利用遗传多样性小鼠资源筛选CA16致病相关基因

彭婉君，赵彬彬，武婧，陈鑫，牛栋，刘江宁

(北京协和医学院比较医学中心 中国医学科学院医学实验动物研究所，国家卫健委人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

手足口病(hand, foot and mouth disease，HFMD)自2008年在中国大陆大规模爆发以来，已成为一种经常流行的病毒性传染病，多发于婴幼儿及5岁以下儿童。大部分患儿一周内能痊愈，轻症表现为手足口部位出现疱疹及斑丘疹；但也有少数患儿可迅速发展为严重的神经系统并发症，如急性弛缓性麻痹、无菌性脑炎、脑脊髓炎、暴发性神经性肺水肿等，病死率较高[1-2]。柯萨奇病毒A16型(Coxsachievirus A16，CA16)是手足口病的主要致病病原之一，与肠道病毒 71 型(Enterovirus 71，EV71)经常交替或同时在中国大陆地区传播，引发严峻的公共卫生问题[3]。随着EV71疫苗的面世，EV71的流行已得到一定的控制，而CA16的传播仍是手足口防控的重点，研究其感染、致病机制和开发特异性疫苗、药物是重中之重[4]。

CA16与EV71一样，都属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirusgenus)人肠病毒A种(humanentereva，HEV-A)，是一种单链RNA病毒[5-6]。虽然CA16与EV71具有相似的形态和基因组构成，但这两种病毒引起的手足口病的临床表现和发病机制存在一定差异[7]。目前研究发现了EV71和CA16共同的病毒受体类致病相关基因SCARB2[8-9]和PSGL-1[10]。近期有研究者发现CA16病毒可通过miR-1303靶向基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP)进而调节血脑屏障的通透性，导致中枢神经系统的病理改变[11]。其感染诱导的自噬也可通过抑制TLR7信号通路，阻碍I型干扰素的产生，最终导致CA16在宿主细胞中成功复制[12]。此外，研究人员还发现维生素D受体(Vitamin D receptor，VDR)高表达可抑制CA16感染[13-14]。但迄今为止CA16病毒明确的致病机制仍尚未阐明，还需进一步研究。病毒作用机制的研究离不开合适的动物模型，目前CA16感染的动物模型主要为单一遗传背景的小鼠、树鼩、以及恒河猴等非人灵长类[15]。灵长类动物实验成本过高，实验周期较长，无法大规模应用。小鼠体型小、繁殖快，是理想的实验动物，但现有的CA16小鼠模型无法完全模拟人体自然感染病毒产生的临床表现，且模型采用乳鼠，可用于感染研究的周期太短，其免疫系统发育不成熟，限制了该模型在研究CA16致病机理中的应用。而遗传多样性小鼠资源(Genetic Diversity Mice，GD Mice)的出现，可部分弥补现有小鼠模型的缺陷。

为了模拟人群的基因多样性、进行复杂性状相关研究，复杂性状联盟(complex trait community，CTC)设计建立了遗传多样性小鼠资源库，将其发展成为一种适用于研究复杂性状或复杂病因疾病的研究工具。遗传多样性小鼠来源于8个亲本品系，分别是A/J、C57BL/6J、NZO/H1LtJ、129S1Sv/ImJ、CAST/EiJ、NOD/ShiLtJ、PWK/PhJ和WSB/EiJ；目前经过8个亲本品系之间的杂交已获得了数百种品系，每种品系都携带有8个原始亲本的遗传信息，覆盖了90%的小鼠遗传多样性。由于遗传多样性小鼠具有清晰的遗传背景、分散的遗传位点和丰富的遗传多样性，可模拟多基因疾病，因此被应用于传染性疾病、肿瘤等人类复杂性疾病的人群易感性及预后研究，并取得突破性进展[16-18]。此外，利用GD小鼠的实验设计简单，实验步骤简便，与经典的遗传学分析比较，利用GD小鼠进行遗传易感性分析具有明显的优势[16]。本研究工作利用遗传多样性小鼠这一新型资源库，从新的角度来筛选与CA16致病相关的基因，同时也获得新的CA16感染的候选模型动物。

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级4 ～ 6周龄的遗传多样性小鼠96只，雌雄各半， 23个品系，体重约为20 g，由中国医学科学院医学实验动物研究所北方中心【SCXK(京)2014-0011】提供。SPF级4 ～ 6周龄C57BL/6小鼠6只，雌雄各半，体重约20 g，购于北京华阜康实验动物技术有限公司【SCXK(京)2014-0008】；本实验得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用和管理委员会的批准(批准号：LJN18001)，于中国医学科学院医学实验动物研究所动物生物安全二级实验室(ABSL-2)中进行实验。实验所用CA16病毒为Shzh05-1毒株(NCBI Accession number: 262658)，储存病毒载量为108copies/mL。

1.1.2 主要试剂与仪器

低温髙速离心机(BECKMAN，美国)，普通PCR仪(T100TMThermal Cycler， Bio-Rad，美国)；超低温冰箱(三洋，日本)；Nano-Zoomer S60 荧光切片扫描仪(日本)；实时荧光定量PCR仪 QuantStudioTM3(ABI，美国)等。cDNA反转录试剂盒(Thermo Scientific，美国)；Trizol 试剂(Life Technologies，美国)；10%福尔马林中性固定液(索莱宝，中国)；实时荧光定量检测染料(Takara，日本)。

1.2 方法

1.2.1 分组

实验组：23个品系的遗传多样性小鼠(表1)；阴性对照组：C57BL/6J 小鼠(Negative Control，NC)；空白对照组：C57BL/6J 小鼠(Blank)。

1.2.2 动物感染

4 ～ 6周龄实验组小鼠及阴性对照组以腹腔注射方式感染100 μL 108Copies/μL CA16 Shzh05-1毒株，空白对照组小鼠腹腔注射100 μL PBS。

1.2.3 样本采集

感染3 d后，采用内眦静脉丛处取血方式获得血液样本，每只取样约 100 μL，并置于 1 mL TRIzol 裂解液中，用于后续核酸提取和病毒载量的检测；小鼠采用脱颈椎处死，之后取后肢骨骼肌，一份置于10%福尔马林固定液中用于后续病理检测；一份液氮速冻，用于核酸提取和病毒载量检测。

1.2.4 血液和组织样本的核酸提取以及病毒载量检测

血液及肌肉组织采用TRIzol法提取RNA，之后用反转录试剂盒将RNA反转为cDNA，并采用染料法进行实时荧光定量PCR测定样本中CA16病毒的核酸拷贝数。

1.2.5 组织病理检测

将后肢骨骼肌于10%福尔马林中固定72 h，经梯度酒精脱水后将其包埋在石蜡中，切片得到的石蜡切片厚度为 5 μm，随后进行苏木精-伊红(HE)染色，最后在光学显微镜下观察组织病理变化。

1.3 统计学分析

实验数据用 GraphPad Prism 6 统计软件进行统计分析；各组数据间的统计学差异采用t-test 进行分析，P< 0.05 为差异具有显著性。

2 实验结果

2.1 CA16病毒在感染小鼠体内扩增情况

本研究采用的Shzh05-1毒株在小鼠模型中临床症状主要为肌肉损伤，为检测病毒在感染小鼠体内的复制扩增情况，在小鼠感染CA16病毒3 d后取血液及后肢骨骼肌组织，经实时荧光定量PCR法测定其中的病毒载量。本实验室前期研究发现，成年C57BL/6J小鼠对CA16病毒不易感，感染后可迅速清除体内病毒，因此将其设置为阴性对照。对血液中病毒载量进行分析(图1A)，发现品系DAVIS血液内病毒载量最高可达108Copies/μL，对照组病毒载量仅有102Copies/μL。将与阴性对照组病毒拷贝数有显著性差异的遗传多样性小鼠品系归为易感品系，发现DAVIS、BOM、POH、FIM、YID这五个品系更为易感。由于实验用毒株的嗜肌性，骨骼肌检测到的病毒载量(图1B)普遍高于血液，大多为105Copies/mg，品系FIM病毒载量最高可达108Copies/mg，阴性对照组为103Copies/mg。血液中病毒载量高的5个品系的骨骼肌病毒载量均高于104Copies/mg，与血液结果相匹配。而有2个品系虽然在血液中病毒载量呈较低水平，但在骨骼肌中病毒载量与对照组相比存在显著性差异，也将其列为易感品系，为FEW、LAM(图1C)。

综上所述，不同品系的遗传多样性小鼠对CA16病毒感染的易感性存在明显差异，分析共筛选出7个易感品系，分别为DAVIS、BOM、POH、FIM、YID、FEW和LAM。

2.2 CA16感染导致遗传多样性小鼠的组织病理变化

如图2A易感品系FEW 所示，遗传多样性小鼠在CA16病毒感染3 d后，取后肢骨骼肌进行病理组织检测，发现易感品系的小鼠后肢肌肉发生明显病理损伤，主要表现为：局灶性细胞变性坏死，间质水肿，炎症细胞浸润等。图2B为不易感品系LOD小鼠肌肉病理表现，损伤较轻，仅有少数炎性细胞浸润。图2C为正常肌肉组织，来自空白对照组C57BL/6J。对比可知，易感品系小鼠病理症状较为严重，而不易感品系小鼠损伤较轻，这与病毒扩增数据相一致。

2.3 The Gene Mine 数据库筛选CA16易感相关基因

The Gene Mine 数据库可分析表型与基因型之间的关系，筛选表型相关基因，专用于遗传多样性小鼠研究[19-20]。以CA16感染的血液病毒载量数据为表型，筛选与之相关的基因位点。分析结果如图3A所示，横坐标为小鼠20对染色体，纵坐标LOD为P值对数值，LOD值越高，表明统计学差异越大，相关性越显著。从图可知，CA16感染致病相关基因主要分布于3号及4号染色体。进一步对3号及4号染色体进行分析，发现了三段核苷酸序列具有高LOD值(图3B、C)，即CA16致病相关基因主要分布于这三段核苷酸序列。图3D、3E则表明了这些基因与亲本品系的相关性，相关性越高则数值越大。由图可知3号染色体上的主效应基因与亲本WSB/EiJ相关性最低，与PWK/PhJ相关性最高； 4号染色体上的主效应基因与与WSB/EiJ相关性最低亲本，NZO/H1LtJ相关性最高。

与此同时，The Gene Mine数据库给出了16个与CA16病毒感染相关基因(表2)。经过生物学功能分类，发现：转运相关基因5个，分别为Slc22a15、Casq2、Dennd2c、Syt6和Atp1a1，其功能主要与钠钾钙离子转运相关；细胞生长相关基因4个，分别为Sycp1、Bcas2、Ngf和Mab21l3；免疫相关基因2个，为白细胞分化抗原Cd2和黏附因子Igsf3，二者均为重要的免疫细胞表面功能分子，在机体对外界病毒感染进行免疫应答反应过程中发挥重要作用；转录调控相关基因2个，为Csde1、Nr1h5；代谢相关基因2个，为Dpyd、Ampd1；癌症相关基因tusc1。

综上所述，利用The Gene Mine数据库进行数据分析发现CA16致病相关主效应基因集中于小鼠3号及4号染色体，并从中筛选出16个候选基因，为后续CA16致病机制研究提供基础。

注：A：CA16易感基因在20对染色体中分布图。B：3号染色体峰值放大图。C：4号染色体峰值放大图。D：3号染色体基因亲本相关性图。E：4号染色体基因亲本相关性图。图3 The Gene Mine MugaQTL 遗传分析图Note. A, Distribution of CA16 susceptibility gene in 20 pairs of chromosomes. B, Peak magnification of chromosome 3. C, Peak magnification of chromosome 4. D, Parental correlation diagram of chromosome 3. E, Parental correlation diagram of chromosome 4.Figure 3 The Gene Mine MugaQTL genetic analysis map

表2 CA16感染致病相关基因列表Table 2 Genes related to CA16 pathogenicity

3 讨论

柯萨奇A16病毒是手足口病的主要致病病原，与EV71病毒成为近年来我国手足口病流行的主导病毒[21]，其感染也可引起严重心肌炎、急性心力衰竭，甚至死亡[22]。传染性疾病在人群中的临床表现存在个体差异性，因此通过单一遗传背景的小鼠已无法建立有效的动物模型复制人类疾病。遗传多样性小鼠以其更加丰富的性状差异与遗传多样性，成为一种研究复杂性状疾病的新型资源，是探究CA16致病相关基因的理想研究对象。

本研究共感染了23个品系的遗传多样性小鼠，不同品系对CA16病毒感染表现出不同易感性，从中我们筛选出7种易感品系，分别为DAVIS、BOM、POH、FIM、YID、FEW和LAM。易感品系小鼠感染病毒后病毒在体内大量扩增，后肢骨骼肌表现出明显病理损伤。在本实验室前期发表文章中，不同品系遗传多样性小鼠对EV71病毒感染同样存在不同易感性，易感品系与CA16比较发现存在5个重叠品系，分别为DAVIS、BOM、POH、FEW、LAM，其主效应基因均与亲本WSB/EiJ相关性最低[20]。之前研究发现CA16与EV71感染在体内复制、病理损伤等方面极为相似，目前EV71与CA16共感染还未有疫苗或针对性药物，该发现将会为手足口病病毒共感染模型建立提供前期基础。

此外，通过The Gene Mine 数据库分析，高效快速的筛选出16个CA16致病相关基因，分别为免疫相关类、代谢相关类、转运相关类、细胞生长相关类、转录调控相关类和癌症相关类。免疫反应是机体抵御外界微生物入侵的主要道防线，免疫相关类基因也是本研究的关注重点。Cd2(CD2 antigen)是目前研究较为透彻T细胞表面抗原，主要由T细胞及自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)表达，可与LFA-3(CD58)和CD48结合使T细胞活化，在适应性免疫中发挥较为重要的作用[23-25]。Igsf3(immunoglobulin superfamily member 3)属于免疫球蛋白超家族[26]。目前研究发现这种膜蛋白，可能具有黏附因子特性，为免疫细胞应答提供活化或抑制信号，具体功能还需深入研究。除此之外，转运相关类基因在候选基因中占较大比重，可通过建立基因敲除小鼠模型进一步深入研究该类基因在CA16感染中的作用。

综上所述，本研究通过遗传多样性小鼠资源筛选出7个CA16感染易感品系，16个感染致病相关基因，为CA16病毒致病机制研究与新型动物模型的建立提供新的思路。其中Cd2与Igsf3基因可能与CA16感染密切相关，下一步将进一步验证这些候选基因，通过建立基因敲除小鼠模型，进一步研究该基因在病毒感染中的具体功能与CA16病毒的致病机制。