慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立与评价

张迪，夏艺，范丽，刘士远，管宇

(海军军医大学附属长征医院，上海 200003)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)是一种慢性气道炎性病变，以持续气流受限为特征。据预测，COPD将在2020年成为全球主要死亡原因第三位及世界疾病经济负担第五位[1-3]。COPD主要由吸烟、二手烟暴露、燃料燃烧产生的烟雾、基因因素等导致[4]。COPD呈进行性发展，即使戒烟，病情仍然会进一步恶化,但早期诊断干预可以有效延缓病程。目前缺乏COPD早期诊断及治疗的有效手段，为解决这一问题，需要进一步了解COPD病程中的病理生理变化。COPD动物模型可在短期内呈现出疾病特点，有助于揭示早期COPD发生发展过程中的动态变化。因此，越来越多的学者致力于构建稳定的、与人类病理生理变化类似的动物模型。

被用来制作COPD模型的动物有很多种，如豚鼠、小鼠、大鼠、猴、羊、牛、猪等[5]。其中大鼠可在烟熏等诱因下快速构建稳定模型，且呈现出与人类相似的病程，因此被广泛应用[6-7]。由于吸烟是COPD的主要诱因，在多种COPD动物模型建立方法中，烟熏模型表现出与人类患者最相似的病理生理特征，包括气道炎症、肺气肿、气道重塑和肺功能受损等。烟熏模型应用广泛，但造模方法(如实验中香烟种类、数量、烟熏频率、总时间等)缺乏统一标准，使研究间的比较相对困难，实验的可重复性不佳，蛋白酶模型也存在这一不足。不同造模方法的结合同样需要标准指导实验，以满足不同的实验需求。此外，目前缺乏不同造模方法的对比研究，造模方法的选择存在困难。

本研究拟采用烟熏、气管内滴注蛋白酶以及两者结合的方式分别建立COPD大鼠模型，对比三者的造模效果，以期为COPD的研究提供稳定可靠的建模方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性II级Wistar大鼠140只，体重(190 ± 10)g，周龄6 ～ 7周，由海军军医大学动物中心提供【SCXK(沪)2018-0006】，饲喂设施由中国人民解放军海军医学研究所【SYXK(军)2017-0041】提供。饲养环境温度控制在(22 ± 2)℃，正常饲养7 d后进行实验。随机分为4组：⑴正常对照组n=20；⑵烟熏组n=60；⑶蛋白酶组n=30；⑷蛋白酶+烟熏组n=30。

1.1.2 试剂与仪器

弹性蛋白酶(南京奥多福尼生物科技有限公司，中国)，香烟(大前门，焦油含量10 mg/根)，1%戊巴比妥钠(天津兰洪新能源科技有限公司，CAS：57-33-0)，4%多聚甲醛溶液(武汉楚江浩宇化工科技发展有限公司，CAS：30525-89-4)，0.9%氯化钠溶液(华润双鹤药业股份有限公司，CAS号：7647-14-5)，无水乙醇(上海处泰化工科技有限公司，CAS号 64-17-5)，纯净水等。

微型计算机D7K67PA(惠普，美国)，SCANCO uCT80 Micro-CT(SCANCO medical AG，瑞士)。

1.2 方法

1.2.1 体重测量

每周测量大鼠的体重，监测各组大鼠体重动态变化规律。

1.2.2 建立模型

烟熏组使用PAB-S200被动吸烟动物染毒系统(烟熏箱大小：80 cm × 60 cm × 58 cm)及香烟进行造模。烟熏过程中使用试管及抽吸装置对大鼠进行间歇烟雾暴露，模拟人类吸烟过程中烟雾暴露模式。每次烟熏同时点燃香烟20根，直至完全燃烧且烟雾基本散尽，共持续40 min，每天烟熏2次，两次间隔时间不少于4 h，一周烟熏6 d。

将蛋白酶组大鼠颈部皮肤及肌肉分离，暴露主气管，使用注射器向主气管内滴注弹性蛋白酶一次，剂量为50 IU/100 g。蛋白酶+烟熏组将气管滴注蛋白酶与烟熏相结合，气管内滴注弹性蛋白酶(50 IU/100 g)后第二天起，按烟熏组的方法进行烟熏处理。

1.2.3 标本制备

烟熏组于烟熏24 h，1、2、4、8、12、16、20、24周处理大鼠各5只，对照组于对应时间处理大鼠各2只，蛋白酶+烟熏组于烟熏24 h，1、2、4、8、12周处理大鼠各5只，蛋白酶组于相应时间处理大鼠各5只。经气管向两侧肺内反复缓慢注入并抽回生理盐水共4.5 mL左右，进行支气管肺泡灌洗。离体肺标本用4%多聚甲醛溶液固定48 h后进行乙醇梯度脱水获得干燥肺标本(图1)。

图1 脱水后的干燥肺标本Figure 1 Dried lung specimen after dehydration

1.2.4 标本Micro-CT检查及图像分析

肺标本行Micro-CT检查。Micro-CT扫描参数：管电压70 kV，管电流144 μA，分辨率18 μm。主观评价CT图像是否出现肺大泡，肺密度减低，炎症等COPD表现，并记录出现时间。

1.2.5 标本病理学检查及图像分析

标本经石蜡包埋后，每个肺叶选取3张切片，行HE染色，镜下观察标本是否出现肺泡扩张、融合，间隔变窄、断裂等改变，并记录出现时间。

肺泡灌洗液1500 r/min离心10 min，留取上清液。采用大鼠白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9, MMP-9)ELISA 试剂盒(深圳欣博盛生物科技有限公司)检测细胞因子IL-10、MMP-9水平。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件。比较组间体重及细胞因子差异时，若数据分布符合正态分布，采用方差分析；否则采用Kruskal-Wallis H检验。以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体重

对4组大鼠进行体重测量，结果如图2、3所示。与对照组相比，烟熏组大鼠及蛋白酶+烟熏组大鼠体重增长缓慢，第7周起烟熏组、蛋白酶+烟熏组大鼠体重增长值与对照组出现差异(P< 0.05)。蛋白酶组与对照组体重增长无显著差异，但蛋白酶组大鼠1 ～ 4周体重增长较对照组稍缓慢。

2.2 细胞因子

本研究中蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组大鼠第24 h、1、2、4周IL-10水平显著低于对照组(P< 0.05，图4)。蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组第24 h MMP-9浓度显著大于对照组(P< 0.05)，此后，蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组MMP-9浓度与对照组虽无显著差异，但较对照组稍高(图5)。烟熏组及对照组间IL-10及MMP-9未见明显差异。

2.3 Micro-CT及病理

对照组Micro-CT图像及病理图像均未见明显异常(图6a)，蛋白酶组、蛋白酶+烟熏组第4周及烟熏组第8周Micro-CT图像均可见肺大泡，局部肺组织密度减低，部分可见炎症，肺内病变分布均匀(图6b1-d1红色箭头标注部分)；病理图像均可见肺泡扩张，间隔变窄，部分肺泡间隔断裂，肺泡融合等(图6b2-d2黑色箭头标注部分)。四组Micro-CT结果与病理结果一致。

图2 烟熏组大鼠及对照组大鼠体重变化Figure 2 Weight gain changes in the smoking group and the control group

图3 蛋白酶组、蛋白酶+烟熏组及对照组大鼠体重变化Figure 3 Weight gain changes in the protease group, the smoking + protease group and the control group

图4 四组大鼠IL-10水平变化Figure 4 Changes of IL-10 concentrations in the four groups

图5 四组大鼠MMP-9水平变化Figure 5 Changes of MMP-9 concentrations in the four groups

注：a：正常对照组；b：烟熏组；c：烟熏+蛋白酶组；d：蛋白酶组。红色箭头：肺大泡，局部肺组织密度减低，可见炎症；黑色箭头：肺泡扩张，间隔变窄，部分肺泡间隔断裂，肺泡融合。图6 四组大鼠Micro-CT及病理表现(HE染色，对照组×200，其他×400)Note. a, Control group. b, Smoking group. c, Smoking+protease group. d, Protease group. Red arrow: pulmonary bullous, reduced density of lung and inflammation. Black arrow: alveolar ectasia, alveolar fusion and alveolar septal destruction.Figure 6 Micro-CT images and photographs of HE-stained lung tissue under optical microscopes (control group, ×200; others, ×400)

3 讨论

理想的动物模型需表现出人类疾病的特点，尽可能使模型发病机理与人类疾病同源，此外还需满足模型制备可重复性高，动物成活率高等条件。目前尚无理想COPD动物模型。啮齿类动物、猴、羊、狗等均可用于COPD动物模型制备，其中大鼠因基因、行为特征及易进行实验干预的特点成为建造COPD模型，模拟人类COPD病程的常用动物。

大鼠是否适用于COPD造模仍存在争议。有研究报道大鼠不易诱发产生COPD[8]，也有研究显示，仅需2个月的烟熏就可观测到大鼠的肺气肿改变[9]。人类对COPD并不易感，需多年的烟熏才会造成COPD。因此，造模时间并非选择造模动物的决定性因素。

COPD造模方法有很多，如烟熏、蛋白酶或脂多糖气管滴注、基因水平造模等[10-12]。本研究选择较常用的烟熏、气管滴注蛋白酶及两者相结合的造模方法。烟熏造模效果与香烟类型，烟雾暴露方法及暴露时间有关，但三者均无统一标准[13-14]。Churg等[15]研究表明产生肺气肿需6个月，而Leberl等[9]只需2个月。本研究采用大前门香烟(焦油含量每根10 mg)及全身暴露的模式对大鼠进行烟熏。蛋白酶—抗蛋白酶失衡学说是COPD发病机制的经典学说，基于此，弹性蛋白酶被广泛应用于COPD模型制作。本研究采用气管内滴注弹性蛋白酶(南京奥多福尼生物科技有限公司)的方法进行造模。

有研究表明IL-10分布广泛，可抑制炎症反应[16-17]。其在COPD病程中的变化过程及作用目前仍存在争议。曾华东等[18]对支气管肺泡灌洗液细胞进行培养，并测定细胞培养上清液中IL-10含量，结果表明COPD组与对照组无明显差异。有研究[19]认为COPD组与正常对照组间血清IL-10水平亦无显著差异。但也有研究[20]发现与正常对照组相比，COPD患者血清IL-10水平下降，说明IL-10参与COPD炎症反应。梁柱等人发现肺泡灌洗液中COPD组IL-10水平明显高于对照组[21]。本研究对烟熏组及对照组的支气管肺泡灌洗液IL-10水平进行测定，发现两组间无显著差异。而蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组大鼠24 h、1、2、4周IL-10水平显著低于对照组。这可能因为24 h～4周蛋白酶产生炎症导致IL-10水平下降，随后蛋白酶逐渐降解，炎症消退。因存在检测误差或试剂盒灵敏度不够可能，不能排除烟熏导致炎症可能。MMP-9为促炎细胞因子，可分解气道和肺组织的细胞外基质及基底膜，参与气道和肺组织的重塑过程。Li等[22]分析923名COPD患者及641名健康受检者细胞因子水平，发现COPD患者血清MMP-9水平显著高于健康对照组。Aneta等[23]的研究表明 COPD患者痰液中MMP-9水平亦高于健康对照组。本研究中烟熏组与对照组MMP-9水平虽无显著差异，但从第8周开始，烟熏组MMP-9水平均较对照组高。表明烟熏组MMP-9存在升高趋势，支持烟熏导致气道炎症。蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组24 h的MMP-9浓度显著大于对照组，此后，蛋白酶组及蛋白酶+烟熏组MMP-9浓度与对照组虽无显著差异但较对照组稍高。细胞因子检测结果表明蛋白酶致炎作用较烟熏显著，可诱导大鼠产生急性炎症；烟熏诱导的炎症发展缓慢，与人类COPD更相似。

COPD患者常存在体重减轻，而体重减轻可能会对COPD患者肌肉功能、健康状态甚至预后产生影响[24-25]。本研究对大鼠体重进行检测，发现烟熏组大鼠及蛋白酶+烟熏组大鼠体重增长较对照组缓慢，这与临床患者表现一致。COPD患者体重减轻原因很多，如炎症[26]，肌肉修复能力受损[27]，低氧血症及二氧化碳潴留引起厌食[28]等。

CT是诊断COPD的重要手段，可直接观察COPD形态学改变，并在吸烟者肺功能受损前发现肺部损害[29]。其中Micro-CT分辨率达到微米级别，可无创、清晰的观测样本内部显微结构，展示疾病动态过程。本研究使用Micro-CT与病理联合评估大鼠肺部改变，发现第4周蛋白酶组、蛋白酶+烟熏组及第8周烟熏组出现COPD表现，同时4周蛋白酶+烟熏组Micro-CT及病理改变程度均高于蛋白酶组。说明烟熏法、蛋白酶气管滴注法及两者相结合构建大鼠COPD模型分别需8周、4周及4周。此外，蛋白酶+烟熏法诱导COPD病变程度高于蛋白酶滴注法。

Micro-CT与病理同步观测到模型大鼠肺部改变，表明Micro-CT对肺部改变非常灵敏，可用于无创动态监测肺部病理变化。总之，本研究表明使用烟熏、蛋白酶及蛋白酶+烟熏的方法均可成功构建大鼠COPD模型。烟熏大鼠模型可更好的模拟人类COPD病程，蛋白酶模型更加快速高效，而蛋白酶+烟熏模型更适于快速模拟中重度COPD。Micro-CT可灵敏真实的反应肺部病理改变。

致谢感谢于志峰博士(上海市第九人民医院)提供图像后处理帮助。