APP/PS1双转基因AD模型小鼠海马区磁共振波谱和超微结构分析

邢敏，毛敬洁,2*，陈文列,2，李钻芳,2

(1. 福建中医药大学中西医结合研究院，福州 350122； 2. 福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福州 350122)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是痴呆的最主要病因，是老龄人口激增的社会背景下的世界性难题。AD的主要临床表现为认知功能缺陷，其典型病变包括由β-淀粉样蛋白(Amyloid-β，Aβ)异常沉积在神经元细胞外形成的老年斑(senile plaque)和过度磷酸化tau蛋白异常沉积在神经元胞内形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangle),以及中枢系统神经元的缺失、炎症损伤和氧化应激等改变[1]。毒性Aβ是淀粉前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)被β水解酶和γ水解酶异常裂解后形成的，γ水解酶的主要组分包含早老素蛋白(presenilin，PS)[2]。作为研究AD的常用动物模型，APP/PS1双转基因鼠可以表达人的淀粉前体蛋白和早老素蛋白，在出生后2月后脑组织中出现β淀粉样蛋白病变和胶质细胞增多，4 ～ 5月后出现老年斑、突触退化、神经元缺失和进行性认知功能减退[3-4]。

氢质子磁共振波谱(proton magnetic resonance spectroscopy，1HMRS)是以结构核磁成像(MR imaging，MRI)为基础的、检测中枢神经系统代谢物水平的方法[5]。作为一种无创性的检查技术，1HMRS已被证实可用于AD的研究和辅助诊断，以评价其病变程度，预测其病程进展，并可将其与路易体痴呆、额颞叶痴呆和血管性痴呆等鉴别诊断[6]，APP/PS1双转基因小鼠模型因较好地模拟AD病理特征和渐进性病程，而被世界广泛公认[7]。但国内外关于AD患者和动物模型的1HMRS检测报道较少，更缺乏对其各代谢物变化病因的深入探讨。本实验通过分析APP/PS1转基因鼠海马区N-乙酰天冬氨酸(N-acetylaspartate， NAA)、肌醇(myo-Inositol，mI)、肌酸(creatine，Cr)、胆碱(choline，Cho)和谷氨酸(glutamate，Glu)等代谢物含量，结合对神经元和星形胶质细胞超微结构的观察，以及行为学的评价，企图寻找APP/PS1小鼠脑组织中各代谢物与超微结构亚细胞层改变间的联系，为能将APP/PS1动物模型更好的应用于AD疾病研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

12只SPF级雌性APP/PS1转基因鼠[B6/JNju- Tg (APPswe, PSEN1dE9)/Nju]和12只同性别、同背景野生鼠(C57BL/6JNju)购于南京大学模式动物研究所【SCXK(苏)2015-0001】，10月龄，以普通成年鼠饲料、蒸馏水、12 h模拟昼夜光照循环、恒温(22±2)℃、相对湿度为(55±5)%等条件于福建中医药大学动物实验中心【SYXK(闽)2014-0001】适应性饲养7 d后进行如下实验。

1.2 方法

1.2.1 新物体识别实验

实验依据Bevins等[8]所描述的方法进行。实验开始前2日，小鼠先于50 cm × 50 cm × 25 cm的树脂箱中每天适应5 min，以排除环境因素的干扰。在训练阶段，将两个完全相同的圆柱状纸盒(直径5 cm，高10 cm)等距地放于装置同一侧，小鼠于对侧中点背对纸盒面壁放入箱中，每只小鼠可以分别地自由探索5 min，探索时间以小鼠鼻在1 cm内指向物体或接触到物体的总时间为计。然后将小鼠放回笼中进入 1 h的记忆阶段。在测试阶段，用一个新的方形物体(5 cm × 5 cm × 5 cm)取代其中的一个柱状物，记录小鼠5 min内在装置中探索新物体的时间、接触物体的总时间和穿梭路径。

1.2.21HMRS检测

使用带有23 mm的小鼠头部表面线圈和12 cm的容积线圈的7.0T超高场磁共振成像仪(70/20USR BioSpec，Bruker，德国)扫描小鼠脑部，数据由Paravision 6.0.1和Bruker Topspin 3.1 PV (Bruker BioSpin, Bruker)采集。小鼠先用含3%异氟烷/30%氧气的混合气体呼吸诱导麻醉，再1.5%异氟烷/30%氧气维持，将其以俯卧位固定于扫描床，以水热循环系统(SC100,Thermo,美国)维持体温于37℃左右，并用动物生理检测仪(SAM PC Monitor，Small Animal Instruments Incorporated，美国)实时监测呼吸频率。使用弛豫增强快速采集序列(rapid acquisition method with relaxation enhancement，RARE；TR=4200 ms，TE=35 ms，FOV=20 × 20 mm，35层，层厚0.5 mm)进行T2加权扫描(T2-weighted images，T2WI)，以获取轴位断层后，选取1.5×1.5×1.5 mm3的右侧海马感兴趣区(region of interest，ROI)，经匀场、抑水后，使用点分辨波谱脉冲序列(point-resolved water suppression pulse sequence，PRESS；TR=1500 ms，TE=20 ms，Scan time=6 min 24 s)扫描获取波谱。各代谢物含量使用Topspin 5.0软件分析，肌酸用作内部参照物以计算其他代谢物的相对含量。NAA、mI、Cr、Cho和Glu的化学移位分别是2.02 ppm、3.56 ppm、3.02 ppm、3.22 ppm和2.2 ppm。

注：A：野生组轨迹图。B：APP/PS1转基因组轨迹图。C：两组小鼠新物体识别实验结果。与野生组比较，*P< 0.05。新物体识别指数=(接触新物体时间/接触物体总时间)×100%。图1 两组小鼠新物体识别实验结果比较Note. A. Locus of wild type mice. B. Locus of APP/PS1 transgenic mice. C. Results of novel object recognition tests. Compared with wild group,*P< 0.05. Novel object recognition index=(Contacting time on new object/ total contacting time on objects) × 100%.Figure 1 Comparison of experimental results of novel object recognition results in two groups of mice (n=12, ± s)

1.2.3 透射电镜技术

小鼠经腹腔麻醉后，使用含2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的PBS (pH 7.4, 4℃)心脏灌流。于冰上迅速剥离脑组织，将海马切成约1×1×3 mm3的小块。分别经戊二醛和四氧化饿前、后固定，乙醇和丙酮梯度脱水，环氧树脂定向包埋，半薄切片定位后, 切90 nm超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，透射电镜观察(H-7650, Hitachi,日本)。

1.3 统计学分析

2 实验结果

2.1 新物体识别实验分析

如图1所示， APP/PS1转基因组总探索时间和新物体识别指数分别为41.7 ± 1.46和51.26 ± 3.67，野生组分别为39.55 ± 1.81和79.03 ± 1.71。APP/PS1转基因组小鼠与野生组相比，总探索时间差异无显著性(P> 0.05)，但新物体识别指数明显下降(P< 0.05)，表明APP/PS1转基因鼠学习记忆力减低。

2.2 代谢物1HMRS分析

APP/PS1转基因组NAA/Cr、mI/Cr、Cho/Cr和Glu/Cr分别为1.73 ± 0.11、0.83 ± 0.06、1.22 ± 0.16和1.07 ± 0.15，野生组非别为1.91 ± 0.21、0.58 ± 0.08、1.11 ± 0.08和1.23 ± 0.17。与野生组相比，APP/PS1转基因组NAA/Cr比值显著减少(P< 0.05)，mI/Cr和Cho/Cr明显增加(P< 0.05)，Glu/Cr比值虽有所下降，但差异无显著性(P> 0.05，图2)。

2.3 细胞超微结构观察

野生组小鼠脑细胞内线粒体散在分布，次级溶酶体少量，突触结构完整(图3A, C)。而与野生组相比，APP/PS1转基因组小鼠海马区神经细胞和星形胶质细胞均发生病理改变，胞质内线粒体大小不一，部分固缩，自噬溶酶体数量增多，其内容物含脂滴样成分；神经元退变、数量减少；星形胶质细胞活化、肿胀，细胞基质变浅，可见自噬泡以及营养障碍性突触 (图3B, D)。

注：A：野生组波谱。B：APP/PS1转基因组波谱。C：两组小鼠海马区各代谢物相对Cr的含量变化。与野生组比较，*P< 0.05。图2 两组小鼠海马区1HMRS检测结果Note. A，1HMRS spectrum of wild type mice. B，1HMRS spectrum of APP/PS1 transgenic mice. C， Relative contents of each metabolite to Cr in hippocampus of two groups. Compared with wild group,*P< 0.05.Figure 2 Results of 1HMRS in hippocampus of mice in two groups (n=12, ± s)

注：A：野生组神经元：线粒体散在分布，自噬溶酶体少量。B：APP/PS1转基因组神经元：线粒体固缩，含脂滴的自噬溶酶体数量增加。 C：野生组星形胶质细胞：线粒体散在。D：APP/PS1转基因组星形胶质细胞：细胞肿胀、激活，吞噬营养障碍性突触，线粒体变性、固缩，溶酶体增多。Nuc: 细胞核；Ly: 溶酶体；Mi: 线粒体；Sy: 突触；Dn：营养障碍性突触。图3 两组小鼠海马区细胞超微结构(× 25 000，标尺=1 μm)。Note. A, Neurons in the wild group: mitochondria scattered and a small number of autolysosomes. B, Neurons of APP/PS1 transgenic group: pyknotic mitochondria, increased number of autophagolysosomes containing lipid droplets. C， Astrocytes in the wild group: mitochondria scattered. D， Astrocytes of APP/PS1 transgenic group: cell swelling, activation, phagocytic dystrophic synapses, mitochondrial degeneration, pyknosis, and increased lysosomes. Nuc: nuclear, Ly: lysosomes, mit: mitochondrion, Sy: synapse, Dn: Dystrophic neurite.Figure 3 Ultrastructure of hippocampal cells in two groups of mice(×25 000, Bar=1 μm)

3 讨论

AD的主要临床表现为记忆力的减退。新物体识别实验利用小鼠相对于较熟悉的物体，更趋向于探索新的物体的习性，来测试小鼠的记忆和认知能力[8]。在本次实验中， 10月龄APP/PS1双转基因小鼠与同龄同背景野生小鼠相比，记忆力明显减退。

1HMRS是一种非侵入性的检测方法，可以将不同化学环境中原子自旋产生的信号沿化学位移轴相互分离，形成由多个波峰组成的波谱，通过计算峰下面积，定量分析感兴趣区(ROI)内各代谢物的含量[9]。通常，AD患者和动物模型中的Cr水平与正常对照相比差异不大，常用作内参来比较其他代谢物的含量变化。本实验的结果表明，10月龄APP/PS1转基因鼠海马区NAA/Cr减少，mI/Cr和Cho/Cr增加。

NAA是神经元线粒体中合成的一种氨基酸，存在于神经元及其轴突内，在神经系统的能量代谢、天冬氨酸转运和渗透压调节等过程中发挥着至关重要的作用，是神经元活力和数量的标志[10]。NAA水平低下，提示该脑区出现功能障碍，亦是区分正常老化和病理性痴呆的神经元标志物。Murray等的研究还证明在AD中，NAA/Cr比值的下降与突触完整性被破坏和磷酸化Tau蛋白的增加有关[11]。神经系统中，mI主要存在于星形胶质细胞内，在神经退化过程中与组织中炎症程度或星形胶质细胞的活化密切相关[12]。在AD中，活化的星形神经胶质细胞多聚集在β淀粉样斑块的周围，因此mI的多少与斑块的数量成正比[13]。脑组织中的胆碱多为磷脂的组成成分，MRS中Cho峰代表了由磷脂酰胆碱裂解而成的甘油磷酰胆碱和磷酸胆碱，其为磷脂双分子层的重要成分，因此Cho峰下面积的增加能够反映细胞膜结构的破坏、炎症反应或细胞增殖[14]。胆碱是合成乙酰胆碱的前体之一，在AD中，Cho的增加很可能是为了弥补乙酰胆碱含量的不足[15]。

本实验将APP/PS1转基因小鼠海马区细胞超微结构与正常小鼠进行对比后，发现转基因小鼠神经元和星形胶质细胞内线粒体固缩，含脂滴的次级溶酶体数量增加；星形胶质细胞肿大增生呈活化状态，并吞噬营养障碍性突触。Aβ的沉积诱发其周围营养障碍性突触的形成，而星形胶质细胞通过包裹、吞噬病变突触，清除突触内的畸变成分，但随着疾病发展，沉积的加剧，这一病理改变促使了炎症反应的增加[16-17]。Aβ还可通过诱导星形胶质细胞释放谷氨酸，引发一系列级联反应，破坏突触的正常形态和功能[18]。由此推测，转基因鼠海马区细胞内线粒体的病变，以及突触结构的异常、神经细胞数量的减少，可能是引起NAA/Cr减少的病因；Aβ的增多及其诱发的异常炎症反应造成了mI/Cr比值的增加；而突触膜结构的破坏、含脂滴的溶酶体数量的增加和乙酰胆碱的不足，则很可能引起Cho/Cr的降低。

目前认为在AD患者的1HMRS检测中，NAA/Cr的减少和mI/Cr的增加是较为公认的结果[19]，以往关于APP/PS1小鼠的1HMRS研究报道也多认为NAA和mI有同样的病理变化[20-22]，但由于检测时小鼠月龄和ROI区域选择的差异，Cho和Glu的检测结果与本实验并不完全相同。Chen等[20]对3、5、8月龄的转基因鼠海马区行1HMRS检测，发现3月龄的转基因鼠即出现mI/Cr的增加，5月龄时出现NAA/Cr的减少，并且这些变化随着年龄的增加而加剧。Chaney等[21]对6、12、18月龄的转基因鼠的海马和背侧丘脑进行检测后发现，随着年龄的增加，NAA和Glu明显减少，Cho显著增加。Liang等[22]对12月龄的转基因鼠的海马区检测后发现NAA/Cr和Glu/Cr降低，mI/Cr上升。

本实验对APP/PS1转基因小鼠进行的1HMRS检测进一步证明这一动物模型可以有效模拟AD病变过程NAA、mI和Cho等代谢物含量的改变，并通过透射电镜观察，发现这些代谢物的变化可能与Aβ的增加引起的星形胶质细胞活化、突触结构破坏、线粒体功能紊乱，以及溶酶体异常有关，为广大AD研究者，更好地探讨阿尔茨海默病的病理机制，提供实验动物参考。