不同年龄段小鼠抑郁及焦虑样行为的比较

杨颖雯，周瑾，黄菲

(上海中医药大学中药研究所, 上海中药标准化研究中心，上海 201203)

抑郁症是一种常见的精神疾病，可以影响思维、情绪和身体健康。它的特点是情绪低落、缺乏活力、悲伤、失眠和无法享受生活等[1]。焦虑是当面对威胁或压力时产生的恐惧感，当面对危险时，这是一种正常的反应，但是，如果它是压倒性的或者这种感觉持续存在，它可以被视为焦虑症[2]。同时出现焦虑和抑郁症状比单独出现的各种症状更为常见，超过三分之二的重度抑郁症患者也报告有焦虑症[3]。研究表明，抑郁与人的年龄差异呈倒“U”型关系[4]，抑郁动物模型是研究抑郁症的重要工具，考察不同年龄的小鼠抑郁焦虑样行为有助于小鼠抑郁模型造模年龄的正确选择，故本实验重点研究抑郁焦虑样行为与小鼠年龄之间的关系。

5-羟色胺(5- hydroxytryptamine 5-HT)是一种多功能生物胺，在一系列生理途径的信号转导中起着重要的作用。我们体内的大部分5-HT都是在胃肠道粘膜内被称为肠嗜铬细胞的特殊的肠内分泌细胞中合成的，它们提供了我们所有的循环5-HT[5]。5-HT主要分布在外围系统中，只有少量的5-HT位于中枢神经系统中，中枢系统中的5-HT是一种重要的神经递质和信号分子，可以调节情绪、睡眠、学习记忆等生理活动。本实验通过行为学和5-HT多层面验证不同年龄小鼠的抑郁焦虑样行为的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

根据文献[6]选择不同年龄的清洁级雄性C57BL/6小鼠27只，9只1月龄，体重(20 ± 2)g；9只8月龄，体重(32 ± 4)g；9只16月龄，体重(37 ± 4)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司【SCXK(沪)2017-0005】，饲养于上海中医药大学实验动物中心清洁级环境【SYXK(沪)2014-0008】，适应性饲养2月后进入实验。实验操作过程中符合上海中医药大学实验动物伦理要求(伦理审批号：SZY201707016)。

1.1.2 试剂及仪器

5-HT(Sigma，H9523)，乙腈(Fisher Chemical，173534)，甲醇(Fisher Chemical，138507)，甲酸(Fisher Chemical，172433)。

低温冷冻离心机(5424R，德国Eppendorf公司)，高通量组织研磨机(TL-48E，上海净信科技公司)，涡旋振荡仪(MX-S，Dragonlab)，液相质谱联用仪(DEBAF01206，安捷伦)，色谱柱(C18-BEH，美国Waters公司)，全自动氮吹浓缩仪(5T250，美国Biotage公司)，悬尾、强迫游泳、开放旷场及高架十字迷宫测试仪(上海移数信息科技有限公司)，行为学分析软件(EthoVision XT，荷兰Noldus公司)。

1.2 方法

1.2.1 悬尾测试(tail suspension test，TST)

将小鼠倒挂并用胶带将尾部黏在在水平杆上，小鼠头部与地面保持7 ～ 8 cm的距离，记录每只小鼠在6 min中的后4 min里的累积不动时间。

1.2.2 强迫游泳测试(forced swimming test，FST)

将小鼠置于装有18 cm深清水的透明柱型容器内(高30 cm，直径20 cm)，并将水温保持在(25 ± 1)℃，记录每只小鼠在6 min中的后4 min里的累积不动时间。

1.2.3 高架十字迷宫测试(elevated plus maze test，EPMT)

将小鼠放在十字迷宫的中间，头面向开臂开始实验，记录5 min内小鼠进入开臂的时间，另记录小鼠的探头次数。每只小鼠测试之后用75%的酒精清洁仪器，并保持实验过程安静且光线均匀。

1.2.4 旷场测试(open field test，OFT)

将小鼠放入实验箱(长60 cm，宽60 cm，高60 cm)中行为学分析软件记录5 min内小鼠的活动总路程。每只小鼠测试之后用75%的酒精清洁仪器，并保持实验过程安静且光线均匀。

1.2.5 糖水偏好测试(sugar preference test，SPT)

测试之前，给每笼小鼠糖水和纯水各一瓶适应1 d，糖水适应结束后，同时给每笼小鼠糖水和纯水各一瓶，测试60 h，测试过程中每12 h交换1次水瓶位置，记录糖水和纯水消耗量，计算糖水偏好率。糖水偏好率等于糖水的消耗量除以糖水和纯水的总消耗量。

1.2.6 LC-MS/MS法检测C57小鼠血清5-羟色胺的含量

血清从-80℃的冰箱取出后放于冰上解冻，完全解冻后吸取100 μL转移至新EP管中，每份样品各加入400 μL的含0.1%甲酸的冰甲醇，涡旋1 min，4℃ 15 000 r/min离心15 min；取上清液，用氮气挥干，每份样品再加100 μL流动相复溶，涡旋混匀，再次4℃15000 rpm离心15 min，取80 μL上清液至液相小瓶中待分析。液相条件：用0.1%甲酸-水、乙腈作为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序：0 ～ 4 min 2%乙腈；6 min 80%乙腈；8 ～ 10 min 90%乙腈；柱温：30℃；流速0.1 mL/min；进样量：10 μL；自动进样器温度：4℃。LC-MS/MS色谱条件参考本实验室已发表文献[7]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 抑郁样行为

2.1.1 悬尾测试

中年组小鼠的不动时间比老年组小鼠的不动时间长，差异具有显著性(P< 0.05)。青年组小鼠的不动时间略短于中年组小鼠的不动时间，但长于老年组小鼠的不动时间，见图1(F(2,24)=4.897)。

2.1.2 强迫游泳测试

青年组小鼠强迫游泳不动时间显著长于中年组(P< 0.001)和老年组小鼠(P< 0.001)；中年组小鼠强迫游泳不动时间亦显著长于老年组小鼠(P< 0.01)，见图2(F(2,24)=38.950)。

2.1.3 糖水偏好测试

老年组小鼠12 h糖水偏好率显著低于青年组(P< 0.05)和中年组小鼠(P< 0.05)，见图3A(F(2,23)=4.909)；青年组小鼠36 h糖水偏好率显著高于老年组小鼠(P< 0.05)，见图3B(F(2,23)=4.703)；青年组小鼠48 h糖水偏好率亦显著高于老年组小鼠(P< 0.05)，见图3C(F(2,23)=5.017)；青年组小鼠60 h糖水偏好率仍显著高于老年组小鼠(P< 0.05)，见图3D(F(2,23)=4.450)。

2.2 焦虑样行为

2.2.1 高架迷宫测试

老年组小鼠开臂时间显著长于青年组(P<0.05)，见图4A(F (2,22)=3.738)；青年组小鼠探头次数显著多于中年组小鼠(P=0.01)，见图4B(F (2,24)=7.460)。

2.3 自主活动(开放旷场测试)

青年组小鼠在旷场中的移动总距离显著大于老年组小鼠(P< 0.05)，见图5(F(2,24)=3.628)。

注：青年组与老年组相比，*P< 0.05。青年组与中年组相比，**P < 0.01。图4 高架十字迷宫实验Note. Young group compared with old group,*P< 0.05. Young group compared with middle-aged group,**P < 0.01.Figure 4 Elevated plus maze test

2.4 LC-MS/MS法检测C57BL/6小鼠血清5-羟色胺含量

如图6(F(2,24)=6.730)所示，青年组、中年组和老年组小鼠血清5-羟色胺含量依次呈递增趋势，青年组小鼠血清5-羟色胺含量显著低于中年组小鼠(P< 0.05)和老年组小鼠(P< 0.01)。

注：青年组与老年组相比，*P< 0.05。图5 旷场总距离Note. Young group compared with old group,*P < 0.05.Figure 5 Total distance travelled in open field

注：青年组与中年组相比，*P < 0.05。青年组与老年组相比，**P < 0.01。图6 小鼠血清中5-羟色胺含量Note. Young group compared with middle-aged group,*P < 0.05. Young group compared with old group,**P < 0.01.Figure 6 Concentration of 5-HT in mice serum

3 讨论

抑郁症和焦虑症是常见的精神疾病，抑郁症更是预计在未来将会发展为继冠心病后的第二大疾病[8]。多种行为学方法被用来评价动物的抑郁及焦虑样行为，本研究选用了常见的悬尾、强迫游泳、糖水偏好、高架十字迷宫和开放旷场测试来评价不同年龄小鼠的抑郁及焦虑样行为。

悬尾测试是用来评价小鼠抑郁行为的实验，当小鼠被挂在水平杆上，一开始会处于本能激烈地挣扎试图逃离困境，但若不能脱困，会陷入绝望状态静止不动，表现出抑郁样行为[9]。本研究中，中年组小鼠不动时间与青年组小鼠接近，明显高于老年组小鼠故提示，青年组小鼠与中年组小鼠比老年组小鼠在悬尾的同一刺激下更易表现出抑郁样行为。强迫游泳测试亦广泛用于评价小鼠抑郁样行为，与悬尾类似的，以不动时间评价抑郁行为状态。本结果提示，在强迫游泳的刺激下，年龄越小越容易表现出抑郁样的行为。糖水偏好测试亦用来测试小鼠抑郁行为，小鼠越不嗜糖，越易出现快感缺失的抑郁状态[10]。在本研究中，各年龄小鼠12、26、48、60 h糖水偏好率整体差距不大，青年组略高于中年组，中年组略高于老年组。高架迷宫测试可以用来评价焦虑样行为，基于动物既想探索新环境又恐惧开放臂的矛盾状态[11]，小鼠进入开臂时间越短越焦虑[12]。本研究中，老年组、中年组、青年组小鼠的焦虑程度呈递增趋势，结果提示，在高架迷宫中，年龄越小越容易表现出焦虑样的行为。开放旷场测试也是用来评价焦虑样行为的，用来考察小鼠自主活动和探究行为[13]，测试过程中小鼠在旷场中活动的总距离越长，则小鼠自主活动越多[14]。本研究结果显示，青年组的自主活动最多，这与青年组小鼠在高架十字迷宫中探头次数增多一致，同时也排除了因自主活动的不同所造成的抑郁或焦虑样行为测试结果的偏差。

5-羟色胺是一种单胺类神经递质，研究表明，抑郁症患者大多会出现5-HT含量下降的情况[15]，李玉波等[16]研究发现抑郁症肝郁脾虚证大鼠模型的海马内5-HT含量降低，李培育等[17]研究发现血清5-HT浓度的增加可治疗焦虑性失眠，缓解焦虑情绪。在本实验中，青年组、中年组、老年组血清5-HT浓度依次增加，故在同样的刺激下，出现抑郁焦虑样行为也依次减少，与行为学结果一致。

本研究通过对不同年龄段小鼠抑郁焦虑样行为的比较发现，整体而言，同一刺激下，小鼠的年龄越小，越易表现出抑郁及焦虑样行为，并且还比较了三组小鼠血清中5-HT的含量，发现青年组小鼠较中年组小鼠以及老年组小鼠血清5-HT水平更低，其中的分子机制还需进一步研究。该结果将有助于选择合适年龄的实验小鼠用于抗抑郁及抗焦虑药物的药效学评价。