羟氯喹对狼疮小鼠脾淋巴细胞的影响

纪丽献，段新旺*，牛海涛

(1.南昌大学第二附属医院风湿免疫科，南昌 330006； 2. 国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室，中国医学科学院医学实验动物研究所，国家中医药管理局，北京 100021)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)简称狼疮，是好发于育龄女性的自身免疫性结缔组织病，主要特点是自身抗体(抗dsDNA抗体、抗ANA抗体等)水平升高及免疫复合物的形成[1]。SLE发病机制尚不明确，研究发现SLE与环境、性别、年龄、遗传等因素有一定相关性[2]。此外，B淋巴细胞与T淋巴细胞免疫耐受的缺失与SLE的发病密切相关[3-4]。SLE临床表现复杂多样，常合并肾病变、神经系统病变、血液系统病变及消化系统病变等。目前临床治疗狼疮的药物主要包括糖皮质激素、免疫抑制剂及抗疟药等[5]。

羟氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)是一种经典的抗疟药，由于其具有免疫抑制、免疫调节和抗炎等特性，也用于临床治疗SLE和类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)等自身免疫性疾病[6]。HCQ治疗SLE的主要机制包括：干扰抗原的加工和表达，减少紫外线对皮肤的反应，减轻氧化应激，阻断Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)信号通路和降低金属样蛋白酶活性等[7-8]。HCQ对关节、皮肤损伤疗效好，可降低狼疮患者动脉粥样硬化发生等风险，减少疾病过程对机体的损害[9]。已有研究发现，在SLE的治疗中，HCQ可以抑制外周血Th17细胞的分化和IL-17的产生[10]。然而，在狼疮的治疗中，HCQ对B淋巴细胞及T淋巴细胞免疫反应的影响研究甚少，因此，本文从脾B淋巴细胞和T淋巴细胞的角度出发，初步探究HCQ对狼疮小鼠外周免疫器官淋巴细胞的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

18只雌性TC小鼠，30周龄，体重(26 ± 3)g。TC小鼠为纯合狼疮小鼠(B6.NZMSle1/2/3)，能充分模拟人类系统性红斑狼疮的疾病表征[11]，由美国佛罗里达大学Morel Laurence教授实验室赠送。所有动物饲养在中国医学科学院医学实验动物研究所SPF动物房【SYXK(京)2015 - 0035】，饲养温度22～ 24℃，湿度40% ～ 70%，12 h光照/12 h黑暗循环照明。所有实验动物操作均符合中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物伦理学要求(伦理审批号：IACUC NHT17002)。

1.1.2 试剂与材料

羟氯喹(批号：0000048213，Sigma公司)；包被抗原dsDNA、酶底物显色剂phosphatase substrate和O.C.T冰冻组织包埋胶均购于Sigma公司；标记抗体Gout Anti-Mouse IgG购于Southern Biotech公司；苏木素、伊红染色液购于北京盈利精细化有限公司；乙醇、二甲苯溶液购于国药集团化学试剂有限公司；Transcription Factor Buffer Set购于BD PharmingenTM公司；CD16/32购于Biolegend公司；流式标记抗体均购于BD HorizonTM公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及实验干预

18只雌性TC小鼠随机分成两组，每组9只，由3个独立实验组成。①实验组：给予10 mg/(kg·d)HCQ灌胃处理；②对照组：给予10 mg/(kg·d)生理盐水灌胃处理。

1.2.2 血清抗dsDNA抗体滴度检测

小鼠脸颊静脉采血50 μL，静置，离心，取上清。ELISA法检测血清抗dsDNA抗体滴度。

1.2.3 肾HE染色

小鼠麻醉处死，取肾组织，4%福尔马林固定，石蜡包埋，切取6 μm厚组织切片进行HE染色，光镜下成像，采用双盲法由2名病理技术人员分别对肾组织学进行形态学分析。肾组织病理评分根据肾小球增大、肾小球萎缩、免疫复合物沉积和炎性浸润程度计算积分：0分，无累及；1分，1% ～ 25%；2分，26% ～ 50%；3分，51% ～ 75%；4分，76% ～ 100%。每只小鼠的肾组织取其皮质下极部分的肾小球，每个肾取10个肾小球，累计积分，计算平均值。

1.2.4 制备小鼠脾淋巴细胞悬液

小鼠麻醉处死，沿腹中线剖开取出脾，以载玻片研磨，悬于1%胎牛血清(1% FBS)中；以70 μm细胞过滤器过滤于15 mL离心管，离心，弃上清；加入5 mL预冷的红细胞裂解液重悬细胞，冰上静置5 min；加入5 mL PBS重悬细胞，离心，弃上清；最后加入1 mL 5% FBS重悬细胞，获取脾淋巴细胞悬液，计数。

1.2.5 细胞染色及流式细胞分析

脾细胞悬液以50 μL CD16/32抗体封闭30 min，加入抗体混合液避光孵育30 min，400 r/min离心5 min，弃上清；加入1 mL预冷多聚甲醛固定20 min，以200 μL PBS重悬细胞，24 h内于流式细胞仪上机检测(BD Symphony A5)，以Flow Jo ver.10(USA)进行数据分析。抗体表面标记为：CD19-BUV737、CD38-PE、CD95-BV510、PNA-FITC、CD3e-APC-Cy7、CD4-BUV395、CD8a-PerCP-Cy5.5、CD25-BB515；胞内标记为：Foxp3-BV421、IL-17 A-BV510。

1.3 统计学分析

采用Graphpad Prism 8.0软件进行统计学分析，两组样本间采用独立样本t检验，两组小鼠抗dsDNA抗体滴度的变化采用Tukey’s检验分析，P< 0.05为差异有统计学意义。

注：A：对照组TC小鼠肾HE染色(× 200，× 400)；B.：实验组TC小鼠肾HE染色(× 200，× 400)； C：肾组织病理学评分(P< 0.05)。图2 两组TC小鼠肾组织病理学改变Note. A, Kidney HE staining of TC mice in control group (× 200, × 400). B, Kidney HE staining of TC mice in experimental group (× 200, × 400). C, Renal histopathology score(P< 0.05).Figure 2 Histopathological changes of kidney in two groups of TC ± s，n=9)

2 结果

2.1 羟氯喹不影响TC小鼠抗dsDNA抗体滴度的变化

分别检测两组TC小鼠处理前、处理2周、处理5周时的血清抗dsDNA抗体滴度，结果均无明显差异，HCQ对抗dsDNA抗体的变化无明显作用(P> 0.05)(图1)。

注：两组小鼠在处理前、处理2周和处理5周时抗dsDNA抗体滴度OD值的变化(P> 0.05)。图1 两组TC小鼠抗dsDNA抗体滴度变化Note. OD value changes in anti-dsDNA antibody titers at pre-gavage, 2 weeks and 5 weeks after treatment in both groups of mice(P> 0.05).Figure 1 Changes of anti-dsDNA antibody titer in two

2.2 羟氯喹可有效缓解TC小鼠肾组织病理损伤

实验组TC小鼠与对照组TC小鼠肾HE染色对比，对照组肾小球增大、肾小球囊腔扩张、肾小球内蛋白样物质沉积增多，肾间质细胞明显增多，上皮细胞水肿，细胞形态紊乱，核碎裂，肾小管水肿，肾血管明显狭窄(图2A)。这些改变在HCQ处理的实验组明显缓解(图2B)，差异有显著性(P< 0.05)(图2C)。

2.3 HCQ 降低TC小鼠B淋巴细胞的高反应性

流式细胞技术检测小鼠脾B淋巴细胞(CD19+)、生发中心B淋巴细胞(Germinal center B cells，CD19+CD38-CD95+PNA+)。结果显示：实验组小鼠B淋巴细胞比例显著低于对照组小鼠(18.5% vs 65.5%，P< 0.05)(图3A)；实验组小鼠生发中心B淋巴细胞比例显著低于对照组小鼠(19.9% vs 76.3%，P< 0.05)(图3B)。

注：A：两组小鼠脾B淋巴细胞比例(P< 0.05)；B.： 两组小鼠脾生发中心B淋巴细胞比例(P< 0.05)。生发中心B淋巴细胞(GCs)圈自CD19+CD38-门。图3 两组TC小鼠脾B淋巴细胞比例Note. A, Proportion of spleen B lymphocytes in two groups of mice (P< 0.05). B, Proportion of B lymphocytes in the spleen germinal center of the two groups (P< 0.05). Germinal center B cells (GCs) gated from CD19+CD38-.Figure 3 Proportion of spleen B lymphocytes in two groups of TC ± s，n=9)

注：A：两组小鼠CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞比例差异无显著性(P> 0.05)。B、C两组小鼠Th17淋巴细胞比例差异无显著性(P> 0.05)。D、E：实验组小鼠Treg淋巴细胞显著高于对照组(P< 0.05)。 Treg细胞圈自CD4+CD8-门。图4 两组TC小鼠脾T淋巴细胞比例Note. A, There was no significant difference in the proportion of CD4+ T lymphocytes and CD8+ T lymphocytes between the two groups of mice (P> 0.05). B and C, There was no significant difference in the proportion of Th17 lymphocytes between the two groups of mice (P> 0.05). D and E, Treg lymphocytes in the experimental group were significantly higher than those in the control group (P< 0.05). The Treg cell gated from CD4+CD8-.Figure 4 Proportion of spleen T lymphocytes in two groups of TC ± s，n=9)

2.4 HCQ升高TC小鼠调节性T淋巴细胞比例

流式细胞仪检测小鼠脾CD4+T淋巴细胞(CD3e+CD4+CD8a-)、CD8+T淋巴细胞(CD3e+CD4-CD8a+)、Th17细胞(CD3e+CD4+CD8a-IL17a+)和调节性T细胞(Treg cells，CD3e+CD4+CD8a-CD25+Foxp3+)。结果显示：实验组小鼠与对照组小鼠相比，CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞比例差异无显著性(P> 0.05)(图4A)；两组小鼠Th17细胞比例差异也无显著性(P> 0.05)(图4B-C)。但是，对比两组小鼠Treg细胞比例，如图4D-E所示实验组小鼠Treg细胞比例显著高于对照组小鼠(1.35% vs 0.13%，P< 0.05)。

3 讨论

3.1 HCQ处理不改变狼疮小鼠抗dsDNA抗体滴度但可缓解肾损伤

本实验发现，生理盐水处理的TC小鼠，抗dsDNA抗体水平持续升高，HCQ处理的TC小鼠，前两周抗dsDNA抗体水平持续升高，第2周至第5周有下降趋势。但两组小鼠在处理前、处理第2周及处理第5周时，抗dsDNA抗体水平变化并无显著性差异。有研究报道，NZBWF1狼疮小鼠经灌胃给予HCQ 5周后，抗dsDNA抗体水平无明显改变[12]。而在另外一篇报道中，NZBWF1狼疮小鼠经HCQ处理12周后，血清抗dsDNA抗体水平明显降低[13]。因此，推测HCQ对抗dsDNA抗体水平的影响可能与给药时间的长短有关。同时，与对照组小鼠相比，实验组小鼠脾浆母细胞和浆细胞的比例变化也无明显差异。由于浆细胞为直接产生抗体的B细胞，因此推测HCQ对抗dsDNA抗体水平无明显影响，是否与HCQ对浆细胞比例无影响之间存在相关性，有待进一步研究。以往研究发现HCQ对NZBWF1狼疮小鼠的肾损伤有预防作用[14]，本实验观察到实验组TC小鼠肾小球增大程度和炎性细胞浸润程度均显著低于对照组TC小鼠，给予HCQ治疗后肾病理评分明显降低，进一步说明HCQ可有效缓解狼疮小鼠肾疾病进展。

3.2 HCQ通过降低B细胞免疫应答而改善狼疮疾病症状

SLE的一个众所周知的特征是B细胞高反应性，B细胞过度激活产生致病性自身抗体，向T细胞呈递抗原，产生细胞因子向炎症部位迁移[15]。在炎症环境中，树突状细胞(dendritic Cells，DCs)捕获抗原并发育成熟，随后迁移到淋巴系统，将抗原呈递给静止的T细胞。活化的T细胞与B细胞相互作用，有利于浆细胞和抗体生成，产生自身免疫应答，狼疮小鼠生发中心B细胞反应性增加[16- 17]。HCQ可以在不同水平上干扰免疫反应，其可以通过抑制TLR7和TLR9的信号来干扰先天免疫的激活[18]。该药物在抗原呈递细胞(DCs、巨噬细胞、B细胞)的溶酶体中的积累可抑制主要组织相容性复合物肽(MHC)向T细胞的呈递，对自身免疫性疾病的发生发展具有抑制作用[19]。因此，HCQ在SLE的治疗中，对外周免疫器官淋巴细胞亚群的比例的影响具有进一步探究的价值。应用流式细胞技术检测两组小鼠脾淋巴细胞的比例，探究HCQ对TC小鼠外周淋巴器官免疫功能状态的影响作用，结果表明， 实验组小鼠脾炎症反应相关B淋巴细胞与生发中心B淋巴细胞比例均显著低于对照组小鼠，提示HCQ可以抑制B淋巴细胞的免疫激活，逆转外周淋巴器官的免疫应答，从而改善疾病状态。

3.3 HCQ可升高狼疮小鼠调节性T淋巴细胞比例而维持免疫稳态

T淋巴细胞包括CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞两个亚群，CD4+主要为辅助性T细胞，CD8+主要为抑制性T细胞和杀伤性T细胞。CD4+T淋巴细胞对狼疮小鼠抗dsDNA抗体的产生有促进作用[20]，De Groo等[21]发现TC小鼠脾中CD8+T淋巴细胞百分比降低。本实验中，两组TC小鼠CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞比例变化均无统计学意义，这提示在SLE的治疗中，HCQ对CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞的免疫应答无明显影响。Treg细胞与Th17细胞是CD4+T淋巴细胞的两个亚群。Treg细胞通过维持免疫稳态和免疫耐受来抑制免疫炎症的发生[22]。在SLE患者发病期间，循环血中Treg细胞数量减少并且细胞的免疫抑制功能受损，恢复Treg细胞数量和功能后可改善狼疮患者的症状，控制疾病的进展[23-24]。相反地，Th17分泌的白细胞介素17(interleukin 17，IL-17)是组织炎症的诱导因子，促进组织炎症应答，诱发自身免疫性疾病[25]。已证实SLE患者外周血中Th17和IL-17产生的数量均增加[23]，此外，在狼疮小鼠模型(MRL/lpr)中也发现了Th17细胞数量的增加[26]。HCQ治疗后的实验组TC小鼠Treg细胞比例明显升高，而Th17细胞比例差异无统计学意义，提示从T淋巴细胞角度分析，HCQ主要通过升高Treg细胞比例而降低炎症反应。

综上，本实验通过对脾淋巴细胞流式分析，发现HCQ可降低炎症性B淋巴细胞比例及升高调节性T淋巴细胞比例，从而缓解狼疮的疾病进展。证实HCQ对外周免疫器官的免疫应答有调节作用，为HCQ在SLE的治疗机制提供理论依据。