BABL/c小鼠感染大肠杆菌O127模型的建立及TGF－β1因子的荧光定量检测

刘一，隋丽华，曾林，宋宏立，武际荣，陈旖，赵彦斌，刘冰，孙兆增*，王新

(1.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109;2.军事医学科学院实验动物中心，北京 100071;3.青岛农业大学海都学院，山东莱阳 265200;4.青岛农业大学校医院，山东 青岛 266109)

转化生长因子(TGF－β1)几乎作用于所有细胞，其生物学活性十分广泛，对于细胞有促进其增殖和增强活性的作用，亦有趋化作用［1］。TGF－β1作为一种转化生长因子具有免疫抑制、促进间质来源细胞的增殖和功能并能诱导许多包括单核细胞、中性粒细胞在内的多种细胞趋化，这表明其在多种炎性反应中起到重要作用［2－4］。小肠结肠炎是一种常见的肠道疾病。目前肠炎性结肠炎模型的建立方法繁多，模型建立成功的鉴定方法标准多但存在检测不敏感、检出率底、检出周期长等特点。建立一种新型快捷的检测方法将会为动物模型的建立创造方便。本实验通过灌胃的方式建立肠炎性小鼠模型，运用荧光定量PCR方法观察TGF－β1在肠炎性反应中的表达特点，以期更进一步了解 TGF－β1与组织器官发生发展的关系，为荧光定量在肠炎性小鼠动物模型检测提供一些参考。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌O127由本室保存，SPF级BALB/c小鼠36只，体重19～21 g，雌雄各半，军事医学科学院实验动物中心提供［SCXK(军)2007－004］，Trizol(Invitrogen，Life Technologies Corporation，美国)，反转录试剂盒(Takara，大连宝生物)，SYBR Premix Ex TaqⅡ(Takara，大连宝生物)，引物由 Invitrogen公司合成，实验于军事医学科学院实验动物中心动物实验室进行［SYXK(军)2007－004］。

1.2 方法

1.2.1 菌落计数

复苏保存菌种 O127，挑取单菌落，37℃过夜培养。利用培养细菌并10倍递增稀释，取1.0×106，1.0×107倍稀释液涂布 LB固体琼脂平板各两块，37℃过夜培养，记录菌落数。求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算原始菌液中的菌体浓度。

1.2.2 建立动物模型

36只小鼠随机分成6组，分别经灌胃给予不同剂量的大肠杆菌，灌胃前禁食24h。1组剂量5×107个，2组剂量 2.5×108个，3组剂量 5×108个，4组剂量2.5×109个，5组剂量5×109个，对照组给予相同剂量的生理盐水。每隔6h观察小鼠形态并记录，72 h后采集结肠组织并保存处理。

1.2.3 总RNA的提取及cDNA的合成

取采集的结肠组织50～100mg，用液氮研磨至粉末状，立即放入1 mL Trizol(Invitrogen公司，TRIzol Reagent试剂)，按照试剂说明书操作。用ND2100微量核酸蛋白定量测定仪测定RNA浓度和A260/280值，判断其质量。cDNA的合成按照试剂盒说明书操作(Takara公司PrimeScriptTMRT Reagent Kit试剂盒)。5 × PrimeScript buffer 4 μL，Prime Script RT Enzyme MixⅠ 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，Total RNA(1000ng/浓度)，RNase Free dH2O 13－VRNA，总体积 20 μL。反应条件，37℃30 min，85℃ 7 s。获得 cDNA 分装后于 －20℃保存。

1.2.4 引物设计

根据GenBank上公布的鼠TGF－β1序列设计引物，其上游引物序列为:5’－ggataccaactattgcttcagtcc－3’，下游引物序列为:5’－aggctccaaatataggggcagg gtc－3’。内参 gapdh 引物上游序列为:5’－actccactcacggcaaattcg－3’，下游序列为:5’－ggcctcaccccatttgatg－3’。引物均由Invitrogen公司合成。

1.2.5 实时荧光定量PCR条件优化

根据Takara公司提供试剂盒反应条件设计实验。样本 cDNA 2 μL，TGF－β1 上下游引物各 1(0.3～1)μL gapdh上下游引物各 1(0.3～1)μL，2×Taq PCR 10 μL，加水补充至 20 μL 体积。反应条件:扩增曲线图绘制，预变性 95℃1 min;变性 94℃ 40 s，退火(50～62)℃ 40 s循环40次;溶解曲线图绘制，95℃1 min;58℃1 min;58℃循环123次(每隔0.3℃采集一次荧光信号)，至94.6℃。在该过程中确定最佳反应体系，最佳反应退火温度。

1.2.6 制作标准曲线

将标准品按浓度梯度5倍倍比稀释，利用上述反应体系与条件，进行荧光定量PCR实验，获得两种基因的标准曲线。

1.2.7 样品检测及统计学分析

利用优化条件对样品进行检测。设无DNA模板的阴性对照。利用所得Ct值跟标准曲线图计算拷贝数。运用SAS软件进行数据分析。组间差异应用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肠炎性小鼠模型的建立

观察发现各实验组与对照组相比，精神萎靡，被毛蓬乱，实验组小鼠均不同程度的出现稀便、软便。解剖发现实验组2组、3组、5组部分小鼠结肠部有出血斑。依据常规肠炎性小鼠模型建立标准的大体形态学和损伤标准判定实验动物模型成立。

2.2 总RNA提取结果

提取的样品总RNA用ND2100微量核酸蛋白定量测定仪测定RNA浓度和A260/280值。各组样品的A260/280值在1.8～2.0之间，纯度较好，可使用。取稀释过的RNA样品6 μL，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测(如图1)，28S、18S两条条带清晰完整，说明提取的总RNA质量可靠无降解。

注:M:DL2000分子质量标准;1～8:不同组随机抽取RNA样本。图1 小鼠结肠组织提取RNA电泳结果图Note:M:DL2000 DNA marker;1 －8:RNA extracted from the colon tissue of the miceFig.1 The results of electrophoresis of the total RNA extracted from the colon tissue of the mice

2.3 实时荧光定量PCR条件优化结果

引物用量为 0.4 μL，总体系20 μL;退火温度为gapdh 58℃，TGF－β158℃。

2.4 荧光定量标准曲线

1.0 E+9，2.0E+8，4.0E+7，8.0E+6，1.6E+6五个浓度梯度倍比稀释。由软件给出所绘图可以得出:所作 TGF－β 标准曲线斜率为 －3.352，r2为0.996，扩增效率为 98.8%;内参 gapdh斜率为－3335。r2为0.995，扩增效率为99.5%。由此可见两个基因的扩增效率良好，此次实验结果准确可信(如图2)。

2.5 试验样品统计

通过分析发现，实验组 TGF－β1的表达水平明显升高。实验组之间无明显差异，与对照组有明显差异。其中P＜0.05，差异有统计学意义。

3 讨论

注:A.TGF－β1标准曲线图;B.gapdh标准曲线图;C.TGF－β1溶解曲线;D.gapdh溶解曲线。图 2 TGF－β1、内参 gapdh 标准曲线Note:A.The linearity of the standard curves for TGF－β1，B.The linearity of the standard curves for gapdh;C.The solubility curve of TGF－β1;D.The solubility curve of gapdh.Fig.2 The standard curves of TGF－β1 and gapdh

肠炎性动物模型的建立方法主要有免疫学方法，化学刺激法，物理刺激法及复合法［5］。模型建立的检测方法亦有多种，主要有免疫组化、血清学、分子生物学等。这些检测技术存在检测不敏感、检出率低、发病率低、检出周期长等不足。本实验通过菌液灌胃的方法亦成功建立肠炎性动物模型，并利用荧光定量PCR法鉴定机体TGF－β1因子的变化检测模型的建立情况，从而确定动物模型建立。

荧光定量PCR是指通过荧光染料或特异性荧光探针，对PCR反应进行实时定量检测，并结合相应的软件对结果进行分析，计算待测样品初始模板量的定量分析方法［6］。与常规PCR方法相比，实时荧光PCR扩增和检测过程一步完成，简化了试验操作步骤，减小了试验误差，且灵敏性高。近年来荧光定量PCR技术渐近成熟，其在一些难以检测的疾病及病毒病、细菌病及寄生虫病的检测中应用广泛［7－9］。其转基因动物实验模型检测中应用较多［10，11］。我们利用其误差小，检测灵敏，检测机体细胞因子的表达量差异，从而准确、快速的确定实验动物模型的建立成功与否。

TGF－β1作为一种有效的免疫抑制剂能够抑制各类淋巴细胞增殖和发挥作用，并具有促进间质来源细胞的增值和功能。其在炎性反应中具有显著变化。对于小鼠肠炎性动物模型建立过程中，由于炎性反应会导致TGF－β1在结肠组织中的表达量发生变化，通过检测其相对表达量可以快速、简便的确定动物模型的建立。

实验通过建立肠炎性动物模型模拟肠炎并通过荧光定量PCR技术检测机体中TGF－β1的表达量。通过实验得出菌液灌胃方法建立动物模型耗时相对较短，检测较为迅速，且与解剖结果基本相符。实验中还发现 TGF－β1在各实验组都有升高，而各实验组比较会发现不同剂量的实验组随着浓度的增加先降低再升高，是否有一定的规律性还需要进一步验证。本实验结果明显，为以后通过利用实时荧光PCR来检测机体某些因子表达量来检测动物模型建立提供了有力依据。

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