鼠疫动物模型：经典与问题

毕玉晶，杨瑞馥

(军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071)

鼠疫动物模型：经典与问题

毕玉晶，杨瑞馥

(军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071)

一直以来，鼠疫菌的研究多围绕致病机制、疫苗效果评价及鼠疫治疗方案选择展开，而合理有效的鼠疫动物模型正是这些实验研究的基础与前提。研究者构建了包括小鼠、豚鼠及非人灵长类模型在内的多种动物模型，而这些模型也为人类认识、防御及治疗鼠疫菌提供了帮助，特别是一些经典动物模型沿用至今。但随着研究的深入，有些动物模型由于存在某种问题而逐渐被淘汰。本文就鼠疫菌动物模型构建以来，不同模型的优势与不足及其应用展开综述，以期为研究者提供参考。

鼠疫菌;模型，动物;致病机制;疫苗

1 鼠疫菌致病性研究中应用的动物模型

1.1 小鼠

小鼠属于哺乳纲、啮齿目、鼠科、小鼠属，来源于野生小家鼠。

从1950年开始，小鼠一直是鼠疫菌分子病原学和疫苗学研究最常用的动物模型［2］。小鼠模型在几个方面都模拟了人类的感染，即高的死亡率、肺部局灶性实变、大量菌血症及肝脾弥散。小鼠感染被描述成两个阶段的疾病，最初的抗炎阶段，发生在吸入感染后36～48 h，接着是快速进展的促炎阶段，出现在感染后4 d直到动物死亡［3-4］。

1949年，Meyer描述了鼠疫菌以注射方式攻击小鼠后疾病的进展，但这与临床所见的腺鼠疫并不一致。动物感染后，鼠疫菌很快到达局部淋巴结，随之进入胸导管和血液中，这种低浓度的菌血症可能持续几个小时，接着细菌进入小鼠的肝、脾及骨髓，不断繁殖的细菌最终导致更加严重的菌血症。

多种方法被应用到小鼠肺鼠疫模型的建立。小的气溶胶颗粒能够诱导原代肺鼠疫，但在很多实例中，采用的气溶胶颗粒大小不尽相同，某些研究得到的并不是原代肺鼠疫，而是颈淋巴结炎和败血症，这可能是由于较大的气溶胶颗粒引发的其他疾病。吸入感染也被报道能引起肺鼠疫，但实际上仅有10%的细菌颗粒能够到达肺部［5］。

Lathem的研究揭示了小鼠肺鼠疫感染模型中出现的明显的双相阶段，即在最初的24～36 h感染呈抗炎阶段，继而在48 h快速进展为促炎阶段，并在3 d内死亡［4］。尽管细菌在肺部以每12 h 10倍的速度增加，但在感染最初的24 h，小鼠不会出现症状。值得注意的是，Lathem的结果与早期的报道明显不一致，早期有研究显示小鼠肺鼠疫感染后24 h内细菌数目是降低的［6-7］。分析两者差异可能由多种原因导致，包括感染途径的差异(气溶胶vs.鼻内感染)、感染菌株差异(139L或 EV-76株 vs.CO92株)、实验小鼠差异(雄性 Namru albino鼠 vs.雌性C57BL/6鼠)及感染菌株培养方式差异(室温vs.37℃)。这些对比表明即使某个研究因素发生改变，研究结果可能会迥然不同。

针对小鼠肺鼠疫感染后出现的两个阶段的疾病变化，不同的研究者对其进行了深入研究。Bubeck等［3］对纯种小鼠(C57BL/6)和杂种小鼠(CD1)原代肺鼠疫感染进行的研究显示，两种小鼠肺部中性粒细胞的募集都是在48 h后才观察到，表明炎症细胞募集到感染地点是迟发的。此外，在支气管肺泡灌洗液中促炎细胞因子(IL-6，TNFα，γIFN，IL-12p70，单核细胞趋化蛋白1)和趋化因子(KC，MIP-2)也是在感染48 h后被检测到，这与肺部中性粒细胞的募集时间是一致的。当CD1小鼠感染由肺炎杆菌引起的肺炎时，在早期即可激发强烈的炎症反应，在支气管肺泡灌洗液中感染后24 h即可出现PMN的募集。这些结果显示，无论是纯种小鼠还是杂种小鼠，在原代肺鼠疫模型中，其肺部PMN的募集和促炎细胞因子和趋化因子的表达都是迟发的，这也解释了肺鼠疫小鼠模型出现的两个阶段的感染现象。类似，Agar等［8］对小鼠肺鼠疫组织病理学观察的基础上，利用Bio-Plex技术对细胞因子(感染后1 h与72 h)的表达谱进行了分析。其中几种促炎因子在感染后72h呈现明显的增加，包括 IL-1β，IL-1α，干扰素 (IFN)-c，IL-12(p70)，肿瘤坏死因子 (TNF)-α，和IL-6。这与其他研究者报道的细胞因子和趋化因子的增加是相一致的［3-4，9］。

我们实验室经吸入感染途径攻击BALB/c小鼠后，感染早期(12 h)和晚期(48 h)获取的肝、肺、脾组织，提取RNA，应用 cDNA芯片技术确定感染过程中差异转录的宿主基因。获得了小鼠不同组织在肺鼠疫感染早期和晚期的全局性转录组数据。综合分析病理学观察、病原菌调控因子转录分析、宿主体内转录组学分析所获得的结果，探讨小鼠肺鼠疫发病过程中，组织病理学改变与病原菌调控因子和(或)其调控的基因以及宿主相应基因转录变化之间的联系。初步了解肺鼠疫感染过程中，宿主和病原菌转录组变化与宿主组织病理改变之间的相关性。在转录水平上从宿主和病原相互作用的角度探究鼠疫菌的致病机制［10］。

综合上述研究，通过鼻内吸入感染鼠疫菌会导致小鼠出现化脓性多病灶渗出性支气管肺炎，与人类感染相似，感染3～4 d后导致动物死亡。尽管细菌迅速增殖，感染的最初阶段相当平静并且本质上是抗炎阶段。随着细胞因子和趋化因子水平的增加，感染快速的进入促炎阶段，细菌扩散入脾，小鼠症状明显直至死亡。

由于在小鼠中观察到的肺鼠疫与人类肺鼠疫的疾病进展和严重性极为相似，并且小鼠相对价格低廉、易于操作，因此，目前的大多数研究以小鼠作为鼠疫菌研究的主要动物模型之一。

1.2 豚鼠

豚鼠属于哺乳纲，啮齿目，豚鼠科的动物，实验豚鼠由野生豚鼠驯化而成。

豚鼠作为鼠疫研究的动物模型在鼠疫菌研究的早期阶段被广泛应用，特别是针对肺鼠疫的研究［11］。研究者发现无论是气管内直接接种，还是向麻醉豚鼠鼻内滴注含有鼠疫菌的悬液，均能产生肺鼠疫模型，通过系列病理切片观察肺鼠疫的发展过程。吸入被感染的颗粒所产生的损害与人原发性肺鼠疫十分相似。病变过程开始于肺泡间膈，表现为严重的细胞浸润，随后是大面积的出血、水肿、血管内细菌繁殖，并扩展到相邻的肺组织。滴注后，早期的损害在支气管，而支气管周围菌团的出现早于肺泡腔内的细胞浸润。随着炎症的发展，死亡时肺炎的损害与人原发性肺鼠疫相似。Strong等将豚鼠暴露于悬有鼠疫菌的气雾中，其中有25%的动物尸检时发现肺炎损害，余下的75%可见颈部淋巴结炎、气管支气管炎和快速致死性败血症。Druett等［12］仔细研究并解释了发生在豚鼠呼吸道两种形式鼠疫的原因。结果发现气溶胶颗粒的大小决定感染的类型，当颗粒直径小于1 μm时，引起支气管肺炎，并可发展为败血症最后导致死亡。直径为10～12 μm的大颗粒沉积在咽喉区域，穿透局部上皮，进入淋巴结，其导致败血症的速度快于鼠疫菌沉积于支气管或肺泡壁的感染途径。由原发灶在颈部淋巴结引起的败血症可引起肺部感染，但无肺炎表现。豚鼠的呼吸道阻止直径大于4 μm的颗粒到达肺，其所引起的鼠疫与人原发性肺鼠疫不同，由这种方法所引起的肺鼠疫，其损害与吸入鼻或支气管接种不同。Meyer和Larson等的研究也推测大颗粒可与鼻和上呼吸道黏膜密切接触，并找到进入淋巴结的入口，从而导致颈部淋巴结的腺鼠疫，或未进入淋巴组织直接侵入血循环而引起败血症。

在豚鼠作为鼠疫菌动物模型进行研究时，需要注意豚鼠模型中出现的减毒现象。F1荚膜抗原是鼠疫菌毒力的一个重要因子，但F1阴性菌株在豚鼠模型中是减毒的，可在小鼠和非人灵长类动物中并未有明显的减毒现象［13-14］;类似地，在 Oyston等［15］的研究中发现，鼠疫菌 aroA突变株在豚鼠实验中是减毒的，而对于小鼠毒性的检测，尽管有死亡时间延长的现象出现，其 LD50与野生株相一致。此外，嘌呤缺陷型菌株及天冬酰胺缺陷型菌株也会在豚鼠中出现减毒，而在其他动物模型中表现为强毒的现象。分析其原因豚鼠血清中存在天冬酰胺酶，可以降解天冬酰胺，对于天冬酰胺缺陷型菌株，没有天冬酰胺可以降解，导致细菌不能正常生长，从而在豚鼠体内呈减毒现象。还应注意的是，在前苏联分离的某些菌株，不是天冬酰胺缺陷型菌株，在多数动物模型不会减毒，而在豚鼠中仍然出现减毒现象，这可能有其他的原因存在。上述发现提示研究者，豚鼠和其他动物模型存在差异，不能被忽略。

尽管早期关于鼠疫菌的研究多以豚鼠作为动物模型，但考虑到以下的几点因素，即无论是皮下感染还是气溶胶形式感染，豚鼠与小鼠出现的疾病及LD50都很相似;某些在其他动物模型中表现为强毒的菌株在豚鼠身上却是减毒株;免疫后豚鼠的反应很特别，不同于其他动物模型［16］。因此，现在很多的研究者不会选择豚鼠作为动物模型。

1.3 大鼠

实验大鼠属于脊椎动物门、哺乳纲、啮齿目、鼠科、大鼠属，由褐家鼠变种而来。

大鼠作为鼠疫菌动物模型进行研究的报道相对较少。在20世纪40年代，有报道对小鼠、大鼠及豚鼠皮下感染鼠疫菌的过程进行了观察，研究中使用的是减毒株［17］。随后，有研究者报道了在不同的大鼠类型中鼠疫菌易感性的差别［18］。他们将大鼠分为三种，其差别主要源自遗传的差别。第一种是易感型，即相当小的剂量就能导致大鼠死亡;第二种是部分抵制型，即可以在小剂量下生存，也有少数动物存在血清转换，在大剂量时获得免疫能力;第三种是即使在更高的剂量下动物仍能生存。

随着研究的进展，有研究者又以大鼠作为动物模型分别探讨了它们在腺鼠疫和肺鼠疫感染中的变化［19-20］。Sebbane 等［19］认为大鼠是与人类城镇鼠疫爆发最有关联的动物，因为与小鼠不同，大鼠感染后的炎性淋巴腺肿在病理上与人类极为相似，此外大鼠在遗传学和免疫学上与豚鼠的特性也很相似。研究者最初观察了三种褐家鼠(Brown Norway(BN)鼠，Sprague-Dawley(SD)鼠，和Wistar(WS)鼠)与两种感染模式(耳部与背部)，以期寻找模拟人类腺鼠疫的最佳动物模型。他们发现三种大鼠在皮下感染鼠疫菌后均出现相似的生理学症状和病理改变。考虑到BN鼠是纯种鼠并且其基因组已经完成测序，最终选择 BN鼠作为腺鼠疫研究的动物模型。研究者观察了鼠疫感染的进程及动力学变化，并对皮下鼠疫菌感染后宿主免疫反应的变化进行了描述。

在Sebbane应用BN大鼠作为动物模型研究腺鼠疫的基础上，Anderson等［20］对 BN鼠作为肺鼠疫研究的可替代的小动物模型进行了评价。滴鼻法感染后，大鼠在感染2～4 d后迅速发展为致死性肺鼠疫，其特点为大量鼠疫菌繁殖所引发的爆发性坏死性肺炎和炎症，并出现严重的肺泡水肿及肺出血。在死亡前24 h，感染动物出现伴有明显延迟炎症反应的系统性疾病。

鼠疫菌在非人灵长类的研究起源于19世纪的印度支那，最初是由前苏联研究者发现的。他们用鼠疫菌感染三种猴类，发现这三种猴类都是极其易感的。到1933年，Taylor等鉴定了这些猴类，即三类猕猴，sinica猕猴，放射猕猴和叶猴。

在早期的研究中，所有对于非人灵长类相关的易感性研究都是基于皮肤感染，不同研究显示了猕猴间的个体差异。但这些较早的研究，对于动物的来源确是未知的，而且大部分都是从野外捕获的，此外当时缺少技术标准，细菌培养方法各异，菌株信息匮乏，因此在参考这些数据应该谨慎。但是，在不考虑易感性的前提下，所有文献都能得到一个结论，即一旦感染动物发病，在不同的非人灵长类动物和人类之间，鼠疫所引发的疾病是相似的。因此，非人灵长类动物在鼠疫菌的研究中，无论是致病性还是疫苗评价，都能起到重要作用。

早期研究多以皮肤感染作为主要感染途径，其引发的多为腺鼠疫。近年来，鼠疫菌的感染方式也呈现多样化，特别可能被生物恐怖分子利用，以气溶胶形式引发肺鼠疫感染［21］，更多的科学家开始了对肺鼠疫的研究，包括在非人灵长类动物中构建肺鼠疫模型。

非人灵长类(NHP)对于气溶胶型鼠疫菌是易感的，其引发的快速致死性疾病与人类发生的原代肺鼠疫是相似的。但应该注意到，不同类型的NHP对于以气溶胶形式感染的鼠疫菌呈现出不同的易感性及疾病进程的差异。

猕猴发生的原代肺鼠疫在很多重要方面都模拟了人类肺鼠疫的发生与进程［22-24］。对于人及猕猴而言，疾病的潜伏期短，病程进展快，出现发热、呼吸急促、心跳过速及某些个体中出现菌血症，不会出现肝脾肿大及淋巴结病，转氨酶实验通常显示血中白细胞增多及广泛的斑片样肺炎。人类与猕猴在疾病上的不同点包括猕猴不会出现咳嗽、咳血、血小板减少症及凝血紊乱。

以鼠疫菌东方型菌株CO92株作为研究靶标，针对鼠疫菌可重现的生物气溶胶的制备方法，及肺鼠疫模型在22只印尼来源的猕猴中的反应进行了评价［25］。在小于 250 cfu的剂量下，5只未出现任何鼠疫感染的症状;15只出现发热、昏睡及厌食症等鼠疫感染的预示症状;剩下的2只尽管没有明显的临床症状，但最终死亡，鼠疫菌培养呈阳性表明鼠疫感染的持续存在。鼠疫菌的致死剂量在人体上是小于100 cfu，本研究中66 cfu导致半数的猕猴出现发热和临床症状(ED50)，同时印尼猕猴出现了很多人类肺鼠疫的症状。因此，研究者认为印尼猕猴可以作为需要猕猴作为研究对象的科学研究中很好的动物模型。相似地，Warren等［26］也对猕猴发生的肺鼠疫进行了报道。通过头部吸入方式18只猕猴感染鼠疫菌 CO92株，结果 LD50为24 cfu，猕猴在发热后34～92 h内死亡，伴随发热同时出现菌血症、呼吸和心率增加、血压降低及昼夜节律失常。组织病理学观察显示肺部的重要改变与肺鼠疫相一致。这些结果表明猕猴在吸入性感染鼠疫菌CO92株后出现的疾病与人类肺鼠疫相似。

在 Andel报道的基础上，Koster等［27］又进一步观察了在非人灵长类的猕猴和人类宿主间发生的肺鼠疫，并比较了两者出现的临床和组织病理学特征，同时鉴定了与小鼠肺鼠疫模型中重要的相似点。发热是系统感染时最先出现的症状，同时也是感染后开始治疗的重要指征。间断的体温检测可能会遗漏发热的开始时间，从而耽误治疗。在所有动物中呼吸急促被检测到;心电图的复极异常，无论是ST段压低还是T波倒置，都是疾病发生不可逆的最重要指标，而这些指标在幸存者中从未出现过。猕猴和人类疾病的差异在于肺鼠疫可能导致猕猴会发生弥漫性血管内凝血(DIC)和慢性肺炎，而人类则会发生急性肺炎但不会伴有DIC。

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在我们实验室的研究中，采用中华猕猴作为研究靶标，系统分析了皮下感染鼠疫菌后，动物出现的病理变化(未发表数据)。感染14d后，在动物的肺、肝、肾、淋巴结及脾均出现组织病理皮损，如肺组织出现出血、渗出、水肿、炎性细胞浸润和脓肿;淋巴结结构缺失、淋巴细胞数目减少、严重的充血和水肿;脾脏的白髓、脾小体及淋巴细胞减少，红髓水肿;肾小球萎缩，肾被膜出现渗出，间质水肿及血管充血。吉姆萨染色、免疫组化染色及超微结构观察，在上述组织中均有鼠疫菌被检出。我们的研究同时证实，皮下感染鼠疫菌导致腺鼠疫，而且其组织病理变化与啮齿类动物及人类鼠疫极为相似。

另一种非人灵长类作为鼠疫动物模型进行较多研究的是非洲绿猴。非洲绿猴(AGM)不是濒危物种，没有乙肝病毒、猿类T细胞白血病病毒、疟疾和其他病原菌，而且从进化角度而言，AGM比亚洲猕猴更接近人类。较早的研究显示，非洲绿猴对于鼠疫菌的气溶胶途径感染呈现高度易感性［13，28］，其LD50大约在 350 cfu［29］。近期，Layton等报道了以鼠疫菌CO92株高剂量气溶胶形式感染10只安装了检测仪的非洲绿猴，对动物的疾病进展进行描述［30］，以期获得确切的致死剂量，鉴定疾病初始的症状，同时对疾病治疗评价的二级时间点进行定义。研究发现，一旦发热持续超过39℃，这大约在感染后52～80 h内发生，就是系统性感染的最初症状，也为开始治疗提供了明确的信号。疾病严重进展的次级信号包括呼吸急促、菌血症、广泛的肺炎及血清乳酸脱氢酶水平的变化。在100倍 LD50剂量上，气溶胶形式的CO92株导致非洲绿猴100%死亡。凝血四项及血小板计数均未出现异常，表明动物没有发生DIC。在人类肺炎中普遍出现并有诊断意义的两个指标，咳嗽和咳血，并未出现在非洲绿猴身上。在感染的非洲绿猴身上观察到的疾病进程及尸检的组织病理学变化，与在小鼠原代肺鼠疫模型中出现的两阶段的疾病进程是相一致的［3-4］。最初的抗炎阶段不会出现发热和疾病的系统症状，这是由于鼠疫菌Yop蛋白的免疫抑制特性介导的;促炎阶段随着发热和呼吸窘迫的出现而快速开始，表明疾病已经由局部肺炎进展到由菌血症引发的弥散性肺泡炎。

综合早期及近期的研究，很多科学家都认为非人灵长类模型在评价鼠疫菌的肺部反应、疫苗效果及治疗方案选定等方面都是最佳的选择。

1.5 其他动物

啮齿类动物是鼠疫菌的主要宿主，因此某些啮齿类动物(如土拨鼠、松鼠、兔子等)也成为鼠疫研究的动物模型。

二十世纪早期，研究者观察了土拨鼠感染肺鼠疫的情况［31］。他们将动物关在一个特殊的木质盒子中，感染雾状鼠疫菌 5～10 min，其致死率为100%，但在13只动物中只有5只发生了原代肺鼠疫，而其余则发生了原代败血症鼠疫。接下来的研究又显示出土拨鼠在吸入鼠疫菌后，不同实验间感染程度的明显差异。随后，有报道指出土拨鼠不能发生原代肺鼠疫，其感染只是继发性肺鼠疫［32］。

近年来，一些研究者提出通常易感的啮齿类动物(如松鼠、土拨鼠)在进入冬眠前可能感染鼠疫菌，在整个冬眠期间感染会在动物体内持续存在，当春天动物苏醒后鼠疫菌在该自然疫源地转为动物传播性疾病［33-34］。研究者观察了当松鼠被鼠疫菌皮下感染后或在冬眠期间被跳蚤叮咬，其感染潜伏存在的可能性［35］。研究者以皮下感染或感染跳蚤叮咬方式攻击松鼠，对冬眠期间感染动物的鼠疫发病情况进行每日检测;如果动物出现死亡，其脾、肝、肺、淋巴结、脑、肾及血液被取出用于细菌学和组织病理学的检测。研究显示，通过皮下感染途径35.8%的松鼠会在8个月内(冬、春及夏季)发生鼠疫;而通过感染的跳蚤叮咬，48.5%的松鼠在3个月内发生感染。这些结果支持了开始的假设，鼠疫菌可以在冬眠期间的松鼠体内潜伏存在，这一现象说明啮齿类动物在冬眠苏醒后可能在动物流行病传播中发挥重要作用。

2 鼠疫疫苗效果评价时应用的动物模型

长期以来人们一直致力于发展一种安全、有效的鼠疫疫苗。从灭活疫苗到减毒活疫苗再到亚单位疫苗，研究者进行了大量的尝试及效果评价。不同的动物模型也被应用到疫苗的免疫效果评价实验中。

2.1 灭活疫苗

早在分离出鼠疫菌的第二年，耶尔森就将鼠疫菌加热杀死，制备灭活疫苗，并在家兔实验中获得了免疫。以美国研究者［36］为代表的一派主张生产使用灭活疫苗，认为弱毒疫苗株在减毒过程中必然会失去某些毒力因子，而使疫苗株的免疫抗原不够完全，不如用强毒株生产灭活疫苗安全有效。因此，人们又尝试了甲醛灭活疫苗(USP疫苗)，并在美国和澳大利亚获得生产许可，美军曾在越南战争中广泛使用它，对防止鼠疫的发生起了一定的作用。但在小鼠模型中，USP疫苗提供的保护效果比EV76疫苗低1000倍［37］。此外，长期的临床试验证明灭活疫苗有局限性：生产安全性差;保护效率低，有效期短，需要在6个月后重复免疫;副反应率高;价格昂贵，而且对肺鼠疫保护效果不佳，这种疫苗于1999年停止生产使用［38］。

2.2 减毒活疫苗

早在1929年人们就尝试着研制减毒活疫苗，Girard和Robic在马达加斯加从一名鼠疫患者分离到一株鼠疫耶尔森菌，在16～20℃培养传代，经过5年成为减毒株(EV株)。EV疫苗株的表现主要为染色体上pgm位点缺失，F1抗原、V抗原保持完整性，动物实验表明该疫苗株可保护小鼠抵御鼠疫菌皮下和吸入途径的侵入［37］。但由于 EV疫苗株仅为pgm位点缺失，其他毒力因子不变，存在毒力回复的可能。如一株可引起鼠兔发生致死性鼠疫的EV菌株，与全毒株极为相似，在经过多次传代后，在豚鼠和白化病小鼠中表现为强毒［39］。随后，研究者又先后研制成功 Tjiwidej、P141、MII40、A1122 和M32等减毒株。但到目前为止，尚无足够研究数据可以评价任何一种鼠疫疫苗的效果或表明疫苗间的相对有效性及耐受性，也没有证据证明任何一种鼠疫疫苗存在远期保护作用。除EV株和我国使用的EV兰株外，其他株都已经被淘汰。减毒鼠疫活菌苗，皮下注射对腺鼠疫保护效果好［40］，但不良反应较大，有潜在的毒性，特别是对肺鼠疫防护效果差和免疫保护期短的缺点限制了该疫苗的使用。尽管人们在减毒活疫苗的研究中又进行了大量的尝试，包括利用基因敲除等技术对疫苗的改进等研究，到目前为止，还没有获得理想的减毒活疫苗。因此，减毒活疫苗仅在俄罗斯和我国有针对危险人群的应用，美国、欧洲、澳大利亚等国家已经终止该疫苗的应用。

2.3 亚单位疫苗

亚单位疫苗是利用微生物的某种表面结构成分(抗原)制成的不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗。鼠疫亚单位疫苗克服了传统疫苗对肺鼠疫保护无效的问题，也是当前鼠疫疫苗研究成果最多的方向。现在研究发现的鼠疫主要抗原和毒力相关因子包括 F1、LcrV、pH6、Yops等，主要起免疫保护作用的为 F1与 LcrV抗原。到目前为止，基于 F1、LcrV抗原基础上的亚单位疫苗在小动物实验中对肺型与腺型鼠疫的保护效果较理想，但要想用于临床人体实验，我们必须对其安全性及免疫机制有着更清楚的了解。

2.3.1 针对F1抗原的亚单位疫苗：F1抗原由鼠疫菌pMT1质粒上的 F1操纵子编码，37℃高度表达，以多聚体的形式在细胞表面形成荚膜，具有抗吞噬作用。高滴度的F1抗体可在被感染的存活个体中检测到，表明F1抗原对人类是一种主要的保护性抗原，灭活及减毒活疫苗中的主要成分即为 F1抗原。Oyston等［41］首先应用一株能表达 F1抗原的AroA突变的鼠伤寒沙门氏菌活菌免疫家兔，结果免疫了兔血清的小鼠可以抵抗100倍LD50鼠疫菌的攻击。Reddin等［42］的实验也表明低剂量的F1抗原微球剂型就能引起小鼠明显的免疫应答和产生保护力。其他的研究也证实F1抗原疫苗能够保护小鼠免受腺鼠疫或肺鼠疫的攻击［40，43］。此外，从 pgmlcrv-CO92减毒株中分离的或在大肠杆菌内重组表达的高度纯化、无内毒素、多聚F1能够诱导产生相同的高效价抗体并在小鼠体内具有相同的保护力，他们在防御鼠疫菌皮下和气溶胶攻击的效果上均高于USP疫苗。

2.3.2 针对LcrV抗原的亚单位疫苗：LcrV抗原为低钙反应刺激原件的组成部分，体外实验表明，在37℃及无外源钙离子存在的条件下，LcrV的表达达到最高值。在体内细菌与真核细胞的接触也可触发LcrV的充分表达。LcrV是一类分泌性蛋白，通过间接途径对Yops的表达、分泌起着正调控作用。在小鼠模型中，加入了铝佐剂的重组V抗原可以保护小鼠免受皮下和吸入途径鼠疫菌的攻击，并且对 F1阴性鼠疫菌同样有效［44-45］。本实验室构建了 rV270疫苗(在LcrV抗原基础上去除具有免疫抑制作用的271-300氨基酸区段)，并对该疫苗在小鼠、豚鼠及兔中的免疫保护效果进行评价，结果显示无论是一次免疫还是两次免疫，均能对小鼠有100%的保护，两次免疫后对豚鼠的保护效果为78.6% ～85.7%，对兔的保护效果为83.3% ～100%［46］。

2.3.3 F1与 LcrV联合/融合的亚单位疫苗：由于F1阴性鼠疫菌株的存在，使仅针对F1抗原的鼠疫疫苗存在局限性。而重组的LcrV疫苗可以保护小鼠免受F1抗原缺失的鼠疫菌的攻击。由于F1和LcrV是鼠疫耶尔森菌的重要保护性抗原和具有种属间的保守性，以及F1-LcrV融合抗原分子在免疫原性和免疫保护性上具有叠加效应，因此，F1与LcrV联合的亚单位疫苗已成为鼠疫新型疫苗研制中首选的保护性抗原分子靶标。表1中列出了F1与LcrV联合/融合疫苗在不同动物模型中的效果评价。无论是纯种小鼠还是杂种小鼠，F1与LcrV联合/融合疫苗免疫后，均能抵抗鼠疫菌皮下或吸入途径的攻击［47-49］。我们实验室针对 F1与 rV270联合疫苗免疫的小鼠，进行了长时间(518d)观察，并在多个时间点采血检测动物体内F1与V抗体的存在情况。在免疫后的 56，216和 518 d，分别采用106CFU鼠疫菌强毒株皮下攻击，结果联合疫苗对小鼠实现了100%的保护［46］。这也是同类实验中免疫后观察时间最长的报道。在针对疫苗保护机制研究中，不同的基因敲除小鼠被应用。其中，与疫苗保护机制明确相关的基因，如转录因子 Stat4，研究发现 F1+LcrV疫苗免疫Stat4－/－小鼠后，不能保护小鼠抵抗鼠疫菌的皮下攻击，即使将免疫后 BALB/c小鼠的CD4+T细胞回输给 Stat4－/－小鼠，仍不能给予小鼠保护，这说明Stat4通路与鼠疫菌致病及F1+LcrV疫苗的保护机制密切相关［50］。其他动物模型，如豚鼠［51］、褐家鼠［20］、黑爪雪貂［52］，在免疫了F1与LcrV疫苗后，都能保护动物抵抗鼠疫菌的攻击。随着研究的深入，开始进行F1与LcrV疫苗在非人类灵长类动物模型中的效果评价，这也是疫苗在临床应用前必须进行的实验。针对本实验室构建的F1与rV270联合疫苗，我们对中华猕猴进行免疫并从抗体反应、保护有效性及细胞因子产生等几个方面进行评价，同时与鼠疫菌疫苗株 EV76株加以比较。结果显示，联合疫苗能够产生高滴度LcrV抗体，而EV76株无V抗体产生，表明联合疫苗在产生V抗体抵抗鼠疫菌方面的作用优于EV76疫苗株。在保护性方面联合疫苗和EV76菌株均能保护中国猕猴抵抗6×106鼠疫菌的皮下攻击［53］。美国军队感染性疾病研究所(USAMRID)在对两类灵长类动物的研究中发现，鼠疫菌的F1/LcrV联合疫苗对于猕猴在气溶胶性鼠疫菌的保护达到80%～100%，而同样条件下非洲绿猴的保护为 0～75%。通过ELISA方法对于抗体滴度检测的差异，已经不能解释F1/LcrV疫苗在灵长类动物中保护性的差异。这表明这类疫苗在人体应用前，还有大量的实验工作需要进行。

表1 F1与LcrV联合/融合疫苗在不同动物模型中的效果评价Tab.1 Efficacy of F1+LcrV vaccine in different animal models

2.4 其他新型疫苗

迄今国内外鼠疫疫苗的研究重点还是蛋白质疫苗，虽然该类疫苗有效但仍存在一些局限性，包括需肌内注射、成本高和需要与佐剂配合使用等。因此，新型疫苗的研发受到人们关注。DNA疫苗可提高免疫原性和保护，还省略了亚单位疫苗蛋白的纯化，为以后鼠疫的预防和控制提供了新思路。针对鼠疫菌F1和LcrV抗原的DNA疫苗延长了抗原表达时间，增强了宿主的体液和细胞免疫反应［59-60］。有研究者报道，能够编码F1抗原的DNA疫苗可以保护小鼠抵抗4000倍 LD50鼠疫菌的攻击［59］。另一种新型疫苗是活载体疫苗，它可通过口鼻途径接种，接种方式简单，适宜于群体的免疫接种。此外，此类疫苗抗原不需要提纯、制备简单、易于储存和运输，可显著降低疫苗的制作成本。研究证实，以不同的重组沙门菌作为载体，构建能够产生F1抗原的疫苗，在小鼠模型中，无论是口服或鼻内吸入均能够保护小鼠抵抗鼠疫菌的攻击［41，61］。类似地，小鼠胃内免疫能够表达V抗原的重组沙门载体疫苗，也能保护小鼠，并且与V抗原特异性抗体反应无关［62］。

3 鼠疫治疗中应用的动物模型

链霉素、四环素和氯霉素是世界卫生组织推荐的鼠疫治疗药物(1970)。链霉素用于治疗鼠疫感染已超过60年，是治疗鼠疫的首选药物之一。由于它的毒性特点以及治疗周期长的特点，逐渐开始应用其他抗生素来取代链霉素用于鼠疫的治疗。通常选择四环素，四环素不但可以用于治疗，而且经常被用做预防性治疗药物。氯霉素由于能够通过血脑屏障，故在治疗鼠疫引起的脑膜炎时起着非常重要的作用［63］。青霉素虽然在体外对鼠疫菌表现为敏感，但被认为对人的鼠疫病治疗无效。氨基糖甙类(链霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素和丁胺卡那霉素)和先锋霉素类(头孢三嗪和头孢他定)被推荐用于治疗F1阴性鼠疫菌引起的感染，这种感染在体内对强力霉素、氨苄青霉素及头孢哌酮无效。在选用治疗鼠疫的药物方面世界各国存在不同看法及应用方法。在越南和美国，认为在腺型鼠疫和败血症型鼠疫病例使用四环素及氯霉素比链霉素能更快地缓解中毒症状，且能防止由链霉素所引起的内毒素休克所导致的死亡。而在我国一直以链霉素作为特效治疗的首选药物，而以磺胺或四环素为辅助治疗药物。

在世卫组织推荐的治疗药物基础之上，研究者也一直致力于更有效的替代抗生素的筛选与鉴定。抗生素的体外抑制鼠疫菌实验表明多种抗生素能够明显抑制鼠疫菌的生长［64-65］。在应用动物模型进行体内抗生素效果评价时，小鼠成为研究者主要的动物模型。

根据不同类型的鼠疫菌感染，在抗生素的选择上也存在差异。针对小鼠腺鼠疫模型，多种抗生素显示出治疗的有效性：包括喹诺酮类的环丙沙星［66-67］和氧氟沙星［68-69］;青霉素类的氨苄青霉素［66］和阿莫西林［68］;利福平［70］;广谱先锋霉素类［71］的头孢三嗪、头孢哌酮、头孢噻肟和头孢他定;及氨基糖甙类抗生素如庆大霉素［72］和奈替霉素［66］。

与腺鼠疫相比，肺鼠疫的抗生素治疗研究相对较少。Byrne等［73］在小鼠模型中对于不同抗生素治疗肺鼠疫感染的效果进行评价，并与链霉素进行了比较研究。结果发现，与链霉素相比，小鼠实验中有效的抗生素包括环丙沙星、氧氟沙星和奈替霉素。这三种抗生素在感染早期(感染后24 h)和晚期(感染后42 h)的效果与链霉素相同。庆大霉素在某一次实验中效果优于链霉素，但只是在高剂量时对于晚期治疗有效。β-内酰胺类抗生素引发多种副作用，尽管在某些动物模型上对于早期感染是有效的，但对所有动物都不能进行晚期治疗。基于上述结果，环丙沙星、氧氟沙星、奈替霉素和庆大霉素可以作为链霉素治疗人类肺鼠疫的替代治疗药品，而青霉素类、先锋霉素类及单β-内酰胺类抗生素则不被推荐。

此外，也有研究者以其他啮齿类动物作为鼠疫抗生素治疗的动物模型。如焦巴太等［74］以家兔作为动物模型，观察了三种抗生素(链霉素、环丙沙星和头孢噻肟钠)对家兔皮下感染鼠疫后的治疗效果。结果显示，环丙沙星组和链霉素组实验结果完全相似，两组动物治愈率为100%，经停药观察14 d后处死，细菌学培养均为阴性;头孢噻肟钠组治愈率仅为50%。因此，研究者推荐环丙沙星用于鼠疫临床治疗，如出现抗链霉素的鼠疫菌株时，环丙沙星可以代替链霉素。

4 结语

感染性疾病的发生实际上是病原体与宿主相互作用的一个互动过程。在此期间，既有病原体为逃避宿主防御机制而进行的改变，也有宿主为清除病原体而调动防御体系的努力。鼠疫作为人畜共患病，鼠疫菌与宿主间的相互作用成为研究鼠疫菌的主要方法。而构建合理的动物模型正是实现鼠疫菌致病机制研究、疫苗评价及抗生素治疗的重要基础。无论是早期广泛应用的豚鼠模型，还是一直沿用至今的小鼠模型，以及与人类发病模式最为相近的非人灵长类模型，在鼠疫菌研究的不同阶段都发挥了重要作用。尽管研究者构建了不同物种的鼠疫菌动物模型，但仍有很多问题需要解决。因此，补充和完善动物模型使其更有效的模拟人类疾病将是鼠疫菌动物模型发展的主要方向。

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Animal model of plague：classics and questions

BI Yu-jing，YANG Rui-fu
Institute of Microbiology and Epidemiology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China

The research on Yersinia pestis greatly focuses on the pathogenetic mechanism，vaccines and treatments.Effective animal models of plague are the basis of these researches.Numerous types of animal models of plague have been developed，including mice，guinea pigs and non-human primates，etc.，and they are useful for understanding，defending and treating this disease.Some classic models are still used at present for different purposes，however，others were discarded because of certain problems.The advantages and disadvantages of different animal models of plague are summarized and discussed in this review.

Yersinia pestis;Animal model;Pathogenetic mechanism;Vaccine;Treatment

Q95－33

A

1005-4847(2011)02-0161-11

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.016

鼠疫是一种古老的自然疫源性疾病，在历史上曾经引起三次世界范围的大流行，夺去了上亿人的生命。二十世纪八十年代以来，在全球范围内，鼠疫的流行呈现出一种活跃态势，发病人数和疫源地面积都有扩大的趋势。2000年，鼠疫被世界卫生组织列为重新抬头的传染病(reemerging disease)［1］。我国存在广泛的鼠疫自然疫源地，面积占我国陆地面积15%左右。新中国成立之后，我国鼠疫发病率得到了有效控制，但仍有散发病例。2000年是近年来我国发生人间鼠疫最多的一年，共213例。进入二十一世纪，国内散发鼠疫病例时有报道。此外，鼠疫病原体－鼠疫耶尔森氏菌历来被列入重要生物制剂范畴，也是国际恐怖分子可能获得的廉价而方便的资源，是目前国际反恐怖主义研究的重要课题之一。无论是鼠疫菌致病机制研究、疫苗效果评价还是鼠疫治疗方案选择，都离不开鼠疫动物模型的构建，也成为研究者深入研究鼠疫菌的重要基础之一。

在鼠疫菌的研究中，研究者尝试了多种动物模型。其中，最为普遍应用的有小鼠、豚鼠，相对较少研究的如大鼠模型。其他动物模型包括松鼠、南非的多乳头鼠、雪貂、各种啮齿类动物、兔类及家猫。随着研究的进展，非人灵长类动物因其独特的优势也被研究者广泛应用。但应注意到，不同动物模型间存在本质差异，不能一概而论。本文综述了多种鼠疫菌动物模型在鼠疫菌致病机制、疫苗研究及抗生素治疗等方面的应用，以期为研究者在选择动物模型时提供参考。

中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室开放课题资助(No.2009CASPMI-001)。

毕玉晶，女，博士，助理研究员，主要研究方向鼠疫菌与宿主相互作用。

杨瑞馥，男，博士，研究员，主要研究方向鼠疫菌致病机制及疫苗研究。Email：ruifuyang@gmail.com

2010-12-13