小鼠超高硫角蛋白基因启动子的克隆及其表达活性分析

李昊，王春生，宁方勇，2，梁洋，朴善花，安铁洙

(1.东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040;2.东北农业大学动物科技学院，哈尔滨 150030)

小鼠超高硫角蛋白基因启动子的克隆及其表达活性分析

李昊1，王春生1，宁方勇1，2，梁洋1，朴善花1，安铁洙1

(1.东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040;2.东北农业大学动物科技学院，哈尔滨 150030)

目的 筛选在小鼠毛囊中具有高表达活性的内源启动子，为建立小鼠被毛特异表达外源蛋白的转基因技术奠定基础。方法 以小鼠基因组为模板，克隆得到超高硫角蛋白基因启动子超高硫角蛋白(UHS)，将其分别与pβgal-Basic和pAcGFP1-N1载体连接，构建了重组真核表达载体。采用阳离子脂质体法转染胎鼠组织块，分析其表达活性。结果 转染后48 h，在蓝光激发条件下可以检测到绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠毛囊区高表达，转染96 h后，表达减弱;此外，转染后48 h，βgal染色结果显示在皮肤块的毛囊区存在蓝色点状区域。结论 UHS启动子在小鼠毛囊中具有表达特异性。

超高硫角蛋白;启动子;分子克隆;活性分析

随着哺乳动物转基因技术的快速发展，利用皮肤特异性启动子的改变动物被毛性状的转基因技术备受关注。Dunn等［1］(1998)利用角蛋白启动子带动生长激素在转基因小鼠的毛囊特异表达。表明在转基因动物生产过程中，正确选择启动子是外源基因在特异组织表达的前提。为了克隆在皮肤中特异且高表达的超高硫角蛋白(ultra-high sulfur keratin，UHS)启动子，本研究利用小鼠肌肉组织，克隆并分析UHS启动子的表达活性，为建立在小鼠皮肤中特异表达外源基因新技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、载体及菌株

rTaq、KpnI、BamHI、SmaI、T4 连接酶;AseI、PstI和AlwNI(NEB);Trizol(Invitrogen);质粒小提小量试剂盒和胶回收试剂盒(Tiangen);pMD18 simple载体、TransDH5α 感 受 态 细 胞 (TRANSGEN)。pAcGFP1-N1(Clontech)，pβgal-basic; β-gal染色试剂盒(Genmed)。

1.2 小鼠基因组提取

取ICR系小鼠(SCXK:J2007-0003)肌肉组织，常规方法提取小鼠基因组。

1.3 引物设计及合成

根据GenBank中小鼠UHS启动子序列(M27685)，利用 primer 5.0设计两对特异性引物U1/U2和 U3/U4，其扩增后的片段长度均为686 bp。在U1/U2引物5’端分别引入 KpnⅠ和 BglⅡ酶切位点用于连接到pAcGFP1-N1载体，在U3/U4引物5’端分别引入 Nde I和 Kpn I用于连接到pβgal-basic载体。引物由大连宝生物公司合成。U1:5’-GGTACCTTGG AACATCCTGCCTAAG;U2:5’-AGATCTATGTGGAGGGAGGAGTTGT;U3:5’-CATATGTTGGAACATCCTGCCTAAG; U4: 5’-GGTACCATGTGGAGGGAGG AGTTGT。

1.4 启动子片段的扩增

PCR 反应体系 25 μL，其中基因组 2 μL(100 ng)，dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μL，rTaq buffer(10 × )2.5 μL，上下游引物各 1 μL，rTaq 酶 0.3 μL。PCR反应条件为:94℃预变性5 min，循环数为30，条件设置为 94℃变性 30 s，54℃退火 45 s，72℃延伸 2 min，结束循环后72℃再延伸7 min。

PCR产物经过胶回收后，分别于pMD18 simple载体连接，转化DH5α型感受态细胞，蓝白斑筛选。挑取白色克隆于含有 Amp的LB培养液中摇菌，小提小量试剂盒提取质粒。

重组质粒的PCR和酶切鉴定后送Invitrogen公司测序。若测序鉴定正确，则重组质粒分别命名为U12-pMD18和 U34-pMD18。

1.5 含启动子片段的真核表达载体的构建

pAcGFP1-N1质粒经AseⅠ和 KpnⅠ双酶切后，回收约4 kb的载体部分，并与U34-pMD18经NdeⅠ和 KpnⅠ酶切获得的约700 bp的启动子部分连接，转化，PCR鉴定和酶切鉴定后获得重组质粒 UGFP;pβgal-Basic质粒经 KpnⅠ和 BglⅡ双酶切后，回收约 7.5 kb的载体部分，并与 U12-pMD18经KpnⅠ和BglⅡ酶切获得的约700 bp的启动子部分连接，转化，PCR鉴定和酶切鉴定后获得重组质粒U-β-gal。

1.6 启动子表达活性检测

颈椎脱臼法处死怀孕18 d母鼠，75%酒精的脱脂棉对其进行处理，解剖取出子宫。在培养皿中取出子宫内的胎儿，分离胎鼠皮肤组织，用眼科镊子仔细的去除附着在皮肤上的脂肪和结缔组织基膜层，露出真皮层。

将上述分离得到的胎鼠皮肤组织置于mPBS的表面皿中清洗3～4次。漂洗后用剪刀将皮肤组织样品剪成小块(1 mm×1 mm ～2 mm×2 mm)。皮肤组织块放在24孔培养板中进行培养，每孔中放入6个左右的皮肤组织小块，每孔加入500 μL含有10%血清的 RPMI 1640培养基，加盖并置于二氧化碳培养箱(5%CO2，37℃，饱和湿度)进行培养。采用阳离子脂质体法分别将U-GFP和-β-gal转染组织块。组织块转染24 h、48 h后取出组织块，在带有蓝光激发装置的倒置显微镜观察报告基因(绿色荧光蛋白)的表达情况，或制作冰冻切片，试剂盒检测β-半乳糖苷酶的表达情况。

2 结果

2.1 小鼠UHS启动子的克隆

经条件摸索后，确定PCR扩增的最佳退火温度及时间。以小鼠基因组为模板，引物扩的PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，可见在约700 bp处的特异扩增带(如图1)。

经酶切鉴定正确的重组质粒送上海生工测序。采用DNAMAN、DNASTAR和 primer 5.0软件进行序列的拼接和分析;并与已发表的参照序列进行比较分析。测序结果:UHS启动子序列大小为682 bp，与GenBank上M27685(小鼠 UHS的参照序列)有98.22%的同源性;在576 bp处有依赖 DNA的RNA聚合酶识别位点 CAAT box，在599 bp处有依赖DNA的RNA聚合酶结合位点TATA box。

2.2 表达载体的构建

鉴定正确的 U34-pMD18 simple用 NdeⅠ和KpnⅠ双酶切，回收短片段，与双酶切(AseⅠ和KpnⅠ酶)去除自身CMV病毒启动子的pAcGFP1-N1载体长片段连接，构成表达载体，命名为U-GFP。因为酶切位点已经改变，所以只能进行PCR鉴定，如图2所示，在700 bp左右扩增出特异条带。

注:1:DL2000;2:PCR产物图1 UHS启动子PCR扩增Note:1.DL2000;2.PCR productsFig.1 The UHS promoter was amplified by RT-PCR

注:1:DL2000;2:U-GFP重组质粒PCR产物图2 U-GFP的PCR鉴定Note:1.DL2000;2:PCR product of U-GFPFig.2 PCR identification of recombinant plasmid UGFP

注:1:PCR产物;2:MarkerⅢ图3 U-β-gal的 PCR 鉴定Note:1.MarkerⅢ;2:PCR product of U-β-galFig.3 PCR identification of U-β-gal

注:1:Marker III;2:假阳性;3:酶切产物图 4 U-β-gal的酶切鉴定Note:1.MarkerⅢ ;2:U-β-gal/BamHⅠ、NcoⅠFig.4 Identification of U-β-galby restriction endonuclease digestion

鉴定正确的 U12-pMD18 simple用 KpnⅠ和BglⅡ酶切，回收短片段，与用KpnⅠ和 BglⅡ双酶切的pβgal-Basic长片段连接，构成表达载体，命名为UHS-β-gal。PCR得到了700 bp左右的片段(如图3)。KpnⅠ和BglⅡ双酶切检测，得到约700 bp和约3000 bp的条带(如图4)，其与理论数值相符。

2.3 小鼠UHS启动子的活性检测

鉴定正确的U-GFP重组质粒转染胎鼠皮肤组织块24 h后，可以观察到毛囊中GFP的表达。参见用UHS-β-gal转染胎鼠皮肤组织块，24 h后用试剂盒进行X-gal染色，并制作冰冻切片。对照组中未发现X-gal染色。转染 U-β-gal重组质粒的皮肤块中存在蓝色点状区域，即箭头指示部位。见图5～8(彩插6)。

3 讨论

已 有 研 究报 道，KAP6［2］、Hox 基 因 Prox1［3］、FGF-2［4］和 KAP7-1［5］等基因在绒山羊不同发育时期的皮肤毛囊呈现特异的表达模式。另据Palmiter等［6］(1982)通过小鼠肝脏组织特异性启动子和大鼠生长激素基因构建融合基因，并通过转基因技术获得“超级鼠”。已有大量的研究结果表明，在转基因动物生产过程中，正确选择启动子是外源基因在特异组织表达的前提。上述结果为通过转基因技术改变动物被毛特性提供了依据。

Powell等［7］(1997)的研究表明，毛发角蛋白基因(K2.9、K2.11、K2.10和 K2.12)仅在毛囊中处于分化中的角质化细胞中表达。K2.10角蛋白属于低硫 II角蛋白，Bawden等［8］(1998)通过构建指导高效表达K2.10角蛋白的载体，并采用显微注射法获得了羊毛光泽和脆性发生改变的转基因绵羊。另据Damak等［9］报道，利用小鼠超硫角蛋白启动子区序列为前导区，可指导IGF1在转基因绵羊表达而能提高羊毛产量。此外，王春生等［10］(2009)为了在绵羊被毛中表达拟蜘蛛丝蛋白基因，建立了转pK2.10-拟蜘蛛丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株。上述结果表明，选择皮肤组织特异性启动子可激活外源基因在皮肤中特异表达。

超高硫角蛋白(ultra-high sulfur keratin，UHS)是毛发特异的结构蛋白，属于毛发角蛋白关联蛋白(keratin associated proteins，KAP) 家族［11］。与动物体的其他蛋白相比，该蛋白家族含有最高的半胱氨酸且富含甘氨酸。与羊毛中超高硫角蛋白只占毛角蛋白组成的小部分不同，在小鼠和人类角蛋白中为主要组分。

为了建立在动物被毛中特异表达外源基因的方法，本研究选择并克隆能够在小鼠被毛中特异表达的小鼠超高硫角蛋白(UHS)启动子(参见图1)，将其连接pAcGFP1-N1载体分别构建了U-GFP(参见图 2)和 U-β-gal表达载体(参见图 3、4)，分别转染胎鼠皮肤组织块，检测其表达活性。其结果，所构建U-GFP载体采用脂质体转染法转染小鼠皮肤成纤维细胞后，经24～48 h，在荧光显微镜下观察到细胞中绿色荧光(参见图 5、6)，表明启动子 UHS可启动GFP基因在小鼠成纤维细胞中具有表达活性;此外，当用 U-β-gal表达载体转染胎数皮肤组织块24 h后，利用试剂盒染色后，在可观察到蓝色的点状区域(参见图8)，表明 UHS启动子可驱动 β-gal在皮肤块细胞中特异表达。

综上所述，本研究所克隆到的小鼠被毛特异表达的UHS启动子，具有在胎鼠皮肤组织中表达的活性，如果将其与目的基因连接就有可能启动外源基因在皮肤毛囊中特异表达，对此有待于进一步探讨。

(本文图5～8见彩插6。)

［1］ Dunn SM，Keough RA，Rogers GE，et al.Regulation of a hair follicle keratin intermediate filament gene promoter［J］.J Cell Sci，1998，111:3487－ 3496.

［2］ 张俊霞，王利，尹俊，等.KAP6基因家族成员在胚胎期山羊皮肤中的表达［J］. 畜牧与饲料科学，2009，(3):20－21，27.

［3］ 席海燕，尹俊，张燕军，等.Hox基因Prox1在绒山羊皮肤中的表达［J］.中国草食动物，2006，(1):84－86.

［4］ 赵源，尹俊，张燕军，等.绒山羊FGF-2结合蛋白基因在皮肤中的表达［J］. 中国草食动物，2006，(1):132－134.

［5］ 张俊霞，尹俊，李金泉，等.KAP7-1基因在内蒙古白绒山羊皮肤中的表达［J］. 中国草食动物，2006，(1):76－77.

［6］ Palmiter RD，Brinster RL，Hammer RE，et al.Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothioneingrowth hormone fusion genes.Nature，1982，300:611－ 615.

［7］ Powell BC，Rogers GE.The formation and structure of human hair［M］.Birkhuser Verlag，1997，59－ 148.

［8］ Bawden CS，Sivaprasad AV，Verma PJ et al.Expression of bacterial cysteine biosynthesis genes in transgenic mice and sheep:toward a new in vivo amino acid biosynthesis pathway and improved wool growth［J］.Transgenic Res，1995(2):87－ 104.

［9］ Damak S，Su H，Jay NP，et al.Improved wool production in transgenic sheep expressing insulin-like growth factor 1.Biotechnology(N Y)，1997，14(2):185－188.

［10］ 王春生，刘欣，原璐，等.转 pK2.10-拟蜘蛛丝蛋白基因绵羊成纤维细胞细胞株的筛选［J］.畜牧兽医学报，2009，40(8):1262－1265.

［11］ Aoki N，Ito K，Ito M.Isolation and characterization of mouse high-glycine/tyrosine proteins［J］.J Biol Chem，1997，272(48):30512－30518.

Cloning and Activity of Mouse Ultra-High Sulfur Keratin Gene Promoter

LI Hao1，WANG Chun-sheng1，NING Fang-yong1，2，Liang Yang1，PIAO Shan-hua1，AN Tie-zhu1
(1.College of Life Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China;2.College of Animal Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

ObjectiveKeratin is the main structure albumen of the mammal wool，which is the most important part of the skin，hair and nail，etc.The aim of this study was to screen ultra-high sulfur keratin promoter in the hair follicles of mouse skin，and provide a basis for establishment of a transgenic technique for hair-specific expression of exogeneous protein.MethodsRegarding the genomic DNA from the mouse as a template，the mouse ultra-high sulfur keratin promoter(UHS)was cloned using molecular biologic methods，identified after conjugation with pMD18 simple vector and then insert it into pAcGFP-N1 plasmid，which had been excised the CMV promoter.After identification by PCR，a recombinant eukaryotic expression vector was constructed.At the same time，the promoter was linked to pβgal-basic，and recombination plasmid U-GFP and U-β-gal were obtained，respectively.The mouse skin tissue pieces were transfected by cationic liposomes of this plasmids.ResultsGFP expression was detected at mouse hair follicle region under blue light ilumination at 48 h after transfection，and the expression was decreased at 96 h after transfection.Moreover，at 48 h after transfection，blue dots of βgal staining were seen at the mouse hair follicle region.ConclusionThe UHS promoter is a tissue-specific promoter in the mouse hair follicles.

Ultra-high sulfur keratin;Promoter;Molecular cloning;Activity analysis;Mouse

图5 蓝光下转染U-GFP的皮肤组织块Fig.5 Skin piece transfected with U-GFP under blue light

图6 蓝光下对照组Fig.6 Skin piece of the control group

图7 对照组冷冻切片Fig.7 A frozen section of the control group

图8 转染U-β-gal重组质粒的皮肤组织块冷冻切片Fig.8 A frozen section of skin piece transfected with U-β-gal

R349.64

A

1005-4847(2010)06-0471-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2010.06.005

2010-06-22

国家自然科学基金资助(编号:30771538);东北林业大学引进人才科研启动基金资助。

李昊(1985－)，男，硕士研究生，研究方向:动物转基因技术。0451-82191785。E-mail:jayhaoli01@126.com

安铁洙，教授，博士生导师，E-mail:antiezhu@tom.com