β-synuclein蛋白原核表达载体的构建与表达

陈安琪，刘学杰，崔晓栋，刘江月，张代娟，郭军堂

(1.潍坊医学院基础医学教学部，山东潍坊 261053;2.潍坊医学院附属医院，山东潍坊 261041)

β-synuclein蛋白原核表达载体的构建与表达

陈安琪1，刘学杰2，崔晓栋1，刘江月1，张代娟1，郭军堂1

(1.潍坊医学院基础医学教学部，山东潍坊 261053;2.潍坊医学院附属医院，山东潍坊 261041)

目的 构建人β-synuclein基因的原核表达载体，分析其在大肠杆菌中的表达。方法 从人脑组织中提取总RNA，用RT-PCR方法获得人β-synuclein基因，克隆至pCUm-T载体中，PCR筛选阳性克隆并测序。将酶切后的目的片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中，转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导后，经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达。结果 RT-PCR扩增出人β-synuclein基因，将其亚克隆至pGEX-6P-1构建成重组表达质粒，并在BL21中表达了β-synuclein蛋白。结论 成功构建人 β-synuclein的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达了人 βsynuclein融合蛋白，为进一步研究β-synuclein在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。

β-synuclein;帕金森病;载体构建

β-synuclein蛋白由 l34个氨基酸组成，是synucleins蛋白家族成员之一。β-synuclein与 αsynuclein是同族异构体，两者在结构上有78%的同源性，但缺失α-synuclein蛋白中部71－82位11个氨基酸长度的 NAC片段［1］。研究发现 β-synuclein能够 抑 制 α-synuclein 聚 集［2］，明 显 的 改 善 αsynuclein转基因鼠出现的动力缺乏，有抑制细胞凋亡的作用［3］，对帕金森病(Parkinson's disease，PD)具有明显的神经保护作用，但具体的机制尚不清楚。研究 β-synuclein与其他蛋白之间的相互作用，对于阐述 β-synuclein的神经保护作用具有重要的意义，但目前国内外关于这方面的研究报道甚少。本研究原核细胞表达带有 GST标签的βsynuclein融合蛋白，为通过GST pull down等方法研究β-synuclein与其他蛋白之间相互作用的研究打下良好的基础。

1 材料方法

1.1 材料

脑组织来源于流产胎儿脑组织;质粒pGEX-6P-1和大肠杆菌 BL21、DH5α为本实验室保存;Trizol、T4DNA连接酶及Pyrobest DNA polymerase购自宝生物工程有限公司;BamHI和 XhoI内切酶、逆转录试剂盒、DNA marker-D、蛋白 marker及 pCUm-T载体购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR:用Trizol从脑组织中抽提总 RNA，取1 μg RNA作为逆转录模板，采用 AMV First Strand cDNA Synthesis试剂盒进行 RT反应。按照试剂盒说明进行操作。

1.2.2 β-synuclein基因的克隆与鉴定:根据Genbank(ID6620)报道序列设计引物，上游引物:5′-GGATCCAGGATGGACGTGTT CATG-3′(含 BamHI酶切位 点)，下 游 引 物:5′-CTCGAGCCTACGCCTCTGGC TCATACT-3′(含 XhoI酶切位点)。采用 Pyrobest DNA polymerase进行PCR扩增。PCR反应条件为:94℃预变性 2 min，循环数为 30，94℃变性 40 s，50℃退火 40 s，72℃延伸90 s，循环结束后再72℃延伸10 min。

1.2.3 pCUm-T-β-synuclein的构建:PCR产物加“A”后与 pCUm-T载体4℃进行连接。取5 μL连接反应液转化 DH5α感受态细菌，进行蓝白斑筛选。挑取白色克隆，少量提取质粒，用BamHI和XhoI双酶切和PCR反应初步鉴定阳性克隆。将酶切鉴定和PCR反应正确的细菌克隆送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.4 原核表达载体的构建:测序正确的质粒pCUm-T-β-synuclein用BamHI和XhoI进行双酶切，纯化回收 419 bp大小的目的片段，与 BamHI和XhoI双酶切的质粒 pGEX-6P-1 4℃反应16 h，然后转化大肠杆菌BL21感受态细菌。少量提取质粒，用BamHI和XhoI双酶切和PCR反应鉴定阳性细菌克隆，获得pGEX-6P-β-synuclein原核表达载体。

1.2.5 原核蛋白的诱导表达:将鉴定正确的菌株常规培养至对数中期(A600为0.5～1.0)，IPTG(终浓度1 mmol/L)诱导6 h收获菌体，PBS重悬后加入溶菌酶(终浓度 1 mg/mL)，冰上放置30 min后，将0.2%Triton X-100注入裂解物中，剧烈震荡混匀后加入DNase和 RNase(终浓度 5 μg/mL)。震荡 10 min后，4℃ 3000 r/min离心 30 min，提取上清并加入 DTT至终浓度1 mmol/L，用0.45 μm滤膜过滤。使用10%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳后。

1.2.6 考马斯亮蓝R250染色:将凝胶放至五倍体积的考马斯亮蓝R250染色液中，摇床上室温缓慢旋转3～4 h。换掉染液，用无染料的甲醇/醋酸溶液浸泡凝胶，缓慢摇动4～8 h脱色，其间换3～4次溶液。继续脱色24 h后，用扫描仪扫描凝胶图像。

2 结果

2.1 RT-PCR结果

扩增后的PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后得到一条约420 bp的特异条带，与目的基因βsynuclein的大小一致(图1)。

1.PCR产物;M.DNA marker-D图1 RT-PCR结果1.PCR products;M.DNA marker-DFig.1 Electrophoresis results of RT-PCR

2.2 pCUm-T-β-synuclein的构建与鉴定

挑取白色克隆，小提质粒后进行 PCR、酶切和测序鉴定。重组质粒经BamHI和XhoI酶切后得到预期的约420 bp和2800 bp大小的两条片段，PCR扩增得到一条约 420 bp大小的条带(图2)。对PCR和酶切鉴定的克隆送上海生工进行测序，测序结果与 Genbank序列(ID6620)进行 Blast序列比对，碱基序列完全一致(结果略)。证实目的基因已经克隆到pCUm-T载体中。

2.3 原核表达载体的构建与鉴定

pGEX-6P-β-synuclein经 PCR扩增得到一条约420 bp大小的条带(图3)。证实目的基因已经克隆到pGEX-6P-1原核表达载体中。

2.4 β-synuclein原核蛋白的表达

将 pGEX-6P-β-synuclein转化大肠杆菌 BL21，经IPTG诱导，收集菌体进行 SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰R-250染色后在预期位置约40×103处有明显的蛋白条带，而未经诱导的重组质粒转化细菌在相应位置则没有相应的蛋白条带(图4)，说明该蛋白在大肠杆菌BL21中成功表达。

1.PCR products;2.BamHI和XhoI酶切结果;M.DNA marker-D图2 重组 pCUm-T-β-synuclein的鉴定1.PCR products;2.pCUm-T-β-synucleindigestedbyBamHIand XhoI;M.DNA marker-DFig.2 Identification of pCUm-T-β-synuclein

M.DNA marker-D;1.PCR products图3 重组 pGEX-6P-β-synuclein PCR鉴定结果M.DNA marker-D;1.PCR productsFig.3 Identification of pGEX-6P-β-synuclein by PCR

1.pGEX-6P-β-synuclein 经诱导;2.pGEX-6P-β-synuclein 未经诱导;M.蛋白Marker图4 重组蛋白β-synuclein的鉴定1.Induced pGEX-6P-β-synuclein; 2.Non-induced pGEX-6P-βsynuclein;M.Protein markerFig.4 Expression of β-synuclein analyzed by SDS-PAGE

3 讨论

β-synuclein没有聚集形成原纤维的倾向，不具有神经细胞毒性作用［4］，能够明显的改善由 αsynuclein聚集引起的神经元变性，对神经元细胞有明显的保护作用［5］。β-synuclein对PD的这种神经保护作用可能与以下因素有关:(1)β-synuclein具有抗氧化作用，能够抑制α-synuclein依赖的氧化应激［6］;(2)β-synuclein能够抑制 α-synuclein 的表达，从而抑制α-synuclein的神经毒性作用［7］。

但具体的保护机制尚未完全明了，这也是目前应用β-synuclein进行PD治疗的主要障碍。

GST pull down是一种经典的用来研究蛋白相互作用的有效方法，为了发现能够与β-synuclein相互作用的蛋白，我们采用RT-PCR法从胚胎脑组织中克隆人β-synuclein基因，并将其克隆至谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-6P-1中。基因经测序证实扩增的目的序列与所需的人β-synuclein基因序列一致，适用于后续的基因表达。我们按照IPTG终浓度1 mmol/L，培养6 h进行蛋白的诱导、收获与检测，在蛋白电泳图中可见约40×103的新增蛋白条带，说明我们已经成功在大肠杆菌中诱导β-synuclein融合蛋白，提取该蛋白的方法可行，为下一步谷胱甘肽亲和柱纯化β-synuclein融合蛋白、GST pull down捕获与β-synuclein作用的蛋白及研究其在PD发病机制中的作用奠定了良好的基础。

［1］ Goedert M.Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases［J］.Nat Rev Neurosci，2001，2(7):492－501.

［2］ Yamin G，Munishkina LA，Karymov MA，et al.Forcing nonamyloidogenic beta-synuclein to fibrillate［J］.Biochemistry，2005，44(25):9096－9107.

［3］ Jakes R，Spillantini MG，Goedert M.Identification of two distinct synucleins from human brain［J］.FEBS Lett，1994，345(1):27－32.

［4］ Wood SJ，Wypych J，Steavenson S，et al.alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease［J］.J Biol Chem，1999，274(28):19509－19512.

［5］ Hashimoto M，Rockenstein E，Mante M，et al.beta-synuclein inhibits alpha-synuclein aggregation:a possible role as an antiparkinsonian factor［J］.Neuron，2001，32(2):213－223.

［6］ Windisch M， Hutter-PaierB， Rockenstein E， etal.Development of a new treatment for Alzheimer's disease and Parkinson's disease using anti-aggregatory β-synuclein-derived peptides［J］.Mol Neurosci，2002，19(1－2):63－69.

［7］ Fan Y，Limprasert P，Murray IV，et al.β-synuclein modulates α-synuclein neurotoxicity by reducing α-synuclein protein expression［J］.Hum Mol Genet，2006，15(20):3002－3011.

Construction of Prokaryotic Expression Vector of β-Synuclein and Expression in E.coli BL21

CHEN An-qi1，LIU Xue-jie2，CUI Xiao-dong1，LIU Jiang-yue1，ZHANG Dai-juan1，GUO Jun-tang1
(1.Department of Basic Medicine;2.Affiliated Hospital，Weifang Medical University，Shandong Weifang 261053，China)

ObjectiveTo construct a prokaryotic expression vector of β-synuclein and analyze its expression in E.coli BL21.MethodsTotal RNA was isolated from human fetal brain tissue.The full-length human β-synuclein cDNA was obtained by RT-PCR and then inserted into pCUm-T vector for sequencing.The target gene fragment was subcloned into pGEX-6P-1 vector correctly and then transformed into E.coli BL21.The expression of β-synuclein was induced with IPTG，and analyzed by SDS-PAGE.Resultsβ-synuclein was amplified by RT-PCR and subcloned into pGEX-6P-1 properly.The recombinant fusion protein was expressed in E.coli BL21.ConclusionThe prokaryotic expression vector of β-synuclein has been successfully constructed and expressed in E.coli BL21，providing a foundation for the further study of β-synuclein in Parkinson's disease.

β-synuclein;Parkinson's disease;Gene expression;E.coli

R742

A

1005-4847(2010)06-0495-03

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.06.010

2010-03-23

山东省卫生厅青年基金(2007QW007);潍坊医学院博士启动基金。

陈安琪(1981－)，讲师，研究方向为帕金森病发病机制。

郭军堂(1973－)，男，副教授，研究方向:帕金森病发病机制。E-mail:guojuntang@sohu.com