慢性应激状态下大鼠睾酮水平测定

刘占东，鲍晓力，张进禄，刘天会，赵焕英，赵君朋，陈珺，赵媛，赵红，王得新

(1.首都医科大学附属北京友谊医院神经内科，北京 100050;2.首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心，北京 100050;3.首都医科大学北京神经科学研究所，北京 100067)

慢性应激状态下大鼠睾酮水平测定

刘占东1，鲍晓力2，张进禄3，刘天会2，赵焕英3，赵君朋3，陈珺1，赵媛1，赵红1，王得新1

(1.首都医科大学附属北京友谊医院神经内科，北京 100050;2.首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心，北京 100050;3.首都医科大学北京神经科学研究所，北京 100067)

目的 通过对于慢性应激模型和运动疲劳模型大鼠的血清睾酮水平的对比研究，探讨慢性应激过程中睾酮水平变化规律及其与发生疲劳的关系。方法 建立大鼠慢性不可预测性应激模型及运动性疲劳模型;应用大鼠轨迹追踪系统对不同应激时间大鼠进行活动量观测，应用放射性免疫法对各组大鼠进行血清总睾酮和游离睾酮进行测定。结果 与正常组比较，慢性应激大鼠第1周组活动量(运动轨迹长度，下同)增加(P＜0.01)，第2周组活动量下降(P＜0.01)。各实验组大鼠游离睾酮与总睾酮之间均存在线性相关。慢性应激各组随应激时间延长，其游离睾酮与总睾酮比值呈逐渐下降趋势，并且能够达到运动疲劳组水平。结论 慢性应激条件可以明显引起大鼠睾酮水平下降。提示分层检测慢性疲劳综合征人群血清总睾酮及游离睾酮的水平以及进行动态性研究可能为本病症的诊断提供生化指标。以游离睾酮与总睾酮比值为指标检测雄性激素水平，能够更好地反映干预因素对动物生理上的影响。

慢性应激;疲劳;睾酮;慢性疲劳综合征

应激是指内外环境剧变刺激时，机体出现的包括精神、神经、内分泌和免疫系统等的综合应答状态。强烈身心应激尤其是长期慢性应激严重影响着人类的身心健康，导致临床疾病、亚健康状态及早衰。目前认为慢性疲劳综合征和抑郁症的发生均与长期应激有关。

研究表明，在运动性疲劳过程中睾酮水平下降，睾酮水平与疲劳恢复程度存在相关性。动物实验发现，悬吊、力竭性运动、高温环境等均可出现大鼠睾酮水平降低。临床研究发现，一些应用男性合成代谢类类固醇的人会表现出攻击性行为，如精神错乱、情绪紊乱、轻度躁狂、易怒和抑郁发作等。在性腺机能不良的患者中，睾酮替代疗法可以明显改善其情绪障碍和性行为;而长时间的睾酮替代能够明显的改善疲劳抑郁等阴性症状，最新研究表明低剂量的睾酮治疗可以明显改善女性抑郁症患者的病情［1，2］。临床上抑郁症患者往往具有明显的疲劳症状，以上证据表明，睾酮水平的变化与应激诱发的疲劳和抑郁等症状之间存在着密切的关系。

长效不可预测性温和应激模型是目前常用的抑郁症药物筛选模型，它的主要设计思路是模仿人类社会经常面对的各种应激因素，通过不定顺序的刺激方式使大鼠不能产生适应而进入疾病状态。我们认为该模型的设计思路与近年国外大量研究的慢性疲劳综合征的发病特点相符合。本研究的主要内容是通过对于慢性应激模型和运动疲劳模型大鼠的血清睾酮水平的对比研究，探讨慢性应激过程中睾酮水平变化规律及其与疲劳发生的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

Wistar雄性大鼠，体质量200～250 g，来源于首都医科大学实验动物科学部【SCXK(京)2007－0001】。本研究获得首都医科大学伦理委员会批准。正常对照组，选取成年Wistar大鼠12只，正常饮食饮水，不给任何刺激，无需孤养。饲养3周后进行行为轨迹记录，脱颈取血，－80℃冷冻保存。

1.2 应激动物模型及分组

选取成年Wistar大鼠48只;共分4组，每组12只，每只单笼饲养。各组动物分别在应激干预后7、14、21和28d进行行为轨迹记录，每只记录30 min后，脱颈取血，标本－80℃冷冻保存。按照改良Katz法进行不可预知应激刺激［3］，包括:4次24 h禁食，4次24 h断水，4次24 h潮湿垫料(鼠盒中加水200 mL)，4次4℃冷水游泳5 min，4次45℃烤箱热烘5 min，4次1 min夹尾，4次5 min高速水平振荡。每天随机给予一种刺激，共刺激28 d，每种刺激不得连续给予。

1.3 大鼠运动轨迹的记录

采用清华大学医学院神经工程研究所设计的大鼠轨迹追踪系统，对正常对照组和慢性应激大鼠进行运动的距离进行量化描述。

1.4 大鼠运动性疲劳模型组

选取成年Wistar大鼠12只，饲养环境同正常大鼠组。

1.4.1 适应训练:采用大鼠平板式运动疲劳仪(Panlab公司，LE8710)，每天训练20 min，每周 5 d，共训练5周。动物适应1～2 d后开始训练，采用递增强度的方式进行跑台运动，坡度为0度。从训练第1周起，每周递增速度分别为 15、22、27、31和35 m/min。一般训练:每周7 d，共2周。每只动物每日按35 m/min的速度，在坡度为0度的跑台上跑20 min。

1.4.2 强化训练:每周7 d，共1周。每只动物每日按35 m/min的速度，在坡度为0度的跑台上跑30 min。最后1周改为每日按42 m/min的速度，在坡度为0度的跑台上跑40 min。当最终大鼠处于运动疲劳状态时，每只大鼠运动后喘息静卧时间达到5 s以上。在完成最后一次运动之后，休息1 h。脱颈取血，标本－80℃冷冻保存［4］。

1.5 血清总睾酮和游离睾酮的测定

1.5.1 实验仪器与试剂:DFM－96型10管放射放免γ计数器、睾酮放免试剂盒 Dsl－4000、游离睾酮放免试剂盒 Dsl－4900(Corporate Headquarrers，USA)，蒸馏水、恒温水浴箱、微量加样器等。

1.5.2 血清总睾酮的测定:按照睾酮和游离睾酮试剂盒操作步骤进行检测。标准曲线的数学模型为logistic四参数拟合，测定时间60 s。总睾酮的标准曲线参数:相关系数 r=－0.9999，标准误差 SD =998.080，Bo/T=39.01%;游离睾酮的标准曲线参数:相关系数 r=－0.9974，标准误差 SD=17.565，Bo/T=39.99%。

2 结果

2.1 大鼠运动距离记录结果

本实验应用大鼠在30 min内的活动距离表示活动量，正常组和各应激组大鼠取材前运动轨迹结果分别为:正常组为(33.16±4.84)m，应激第1周组为(56.10±12.20)m，应激第 2周组为(24.03±4.93)m，应激第3周组为(27.39±5.76)m，应激第4周组为(34.12±6.73)m。应用 SPSS统计软件，通过单因素方差分析发现与正常组比较，应激第1周组大鼠活动量明显增加(P=0.000);第2周组大鼠活动量较正常明显下降(P=0.005);第3周虽然活动距离比正常组仍缩短，但在统计学上不存在显著性差异(P=0.073);而在应激第4周时大鼠的活动距离已经基本恢复到正常组水平(P=0.763)。

2.2 各组大鼠游离睾酮与总睾酮水平的相关性分析

应用SPSS统计软件，通过各组大鼠游离睾酮与总睾酮水平的线性相关分析发现，二者之间存在高度的相关性，且各组相关系数的 P值均为0.000。其相关方程分别为:①正常组:总睾酮(ng/mL)=0.441×游离睾酮(pg/mL)+0.978，R2=0.966。②应激第1周组:总睾酮(ng/mL)=0.693×游离睾酮(pg/mL)－1.385，R2=0.959。③应激第 2周组:总睾酮(ng/mL)=0.568×游离睾酮(pg/mL)+0.049，R2=0.994。④应激第 3周组:总睾酮(ng/mL)=0.641×游离睾酮(pg/mL)－0.198，R2=0.988。⑤应激第 4周组:总睾酮(ng/mL)=0.589×游离睾酮(pg/mL)+0.134，R2=0.981。⑥运动疲劳组:总睾酮(ng/mL)=0.448×游离睾酮(pg/mL)+1.172，R2=0.952。

2.3 不同组大鼠睾酮水平

应用SPSS统计软件，通过单因素方差分析发现，与正常组比较，应激第4周组总睾酮水平明显下降(P=0.022);游离睾酮总体水平呈下降趋势，其中应激第2周组和第4周组具有统计学差异(P值分别为0.029和0.008);以游离睾酮与总睾酮比值(FT/TT)作为统计量进行单因素方差分析，发现各组大鼠比正常组均出现下降。除应激第1周组外，其他各组均出现了统计学差异，其中应激第2周组为显著性下降(P＜0.05)，其他各组均为非常显著性下降(P＜0.01)。结果如表1所示，其中 A、B、C、D、E、F分别代表正常组、应激第1周组、应激第2周组、应激第3周组、应激第4周组和中枢性运动疲劳组。

表1 不同组大鼠睾酮(TT)和游离睾酮(FT)水平Tab.1 The testosterone(TT)and free testosterone(FT)levels in the rats of different groups

3 讨论

本研究结果表明，运动疲劳模型大鼠的血睾酮和游离睾酮水平虽比正常大鼠降低，但未出现统计学差异，而游离睾酮与总睾酮的比值与正常组相比呈明显下降(P＜0.01)。在慢性应激模型大鼠中，应激第4周组总睾酮和游离睾酮的水平均明显降低，第2周组游离睾酮水平也明显下降，但总睾酮未出现统计学差异。应激第3周组没有出现统计学差异，可能与该组动物基础睾酮水平偏高有关。本研究发现，各个实验组的标准差均较大，说明不同大鼠间睾酮水平的个体差异较大。因此，如果单纯以总睾酮和游离睾酮为指标进行研究则需要较大的样本量。通过各组游离睾酮和总睾酮之间的线性回归分析发现，二者存在很好的线性相关性，因而可以采用游离睾酮与总睾酮比值作为统计量进行分析。这样既能够很好消除不同大鼠之间睾酮水平的个体差异，又能够直接反映出主要发挥功能的游离睾酮水平在总睾酮中所占比例的变化情况，因而能够比较全面的反映出干预因素对于雄性激素水平变化的作用。Kuoppasalm［5］发现运动员在长跑和短跑时，血浆睾酮和类固醇结合球蛋白的比例不变，总睾酮和游离睾酮的变化始终是平行的。这与我们的研究结果相似。我们的结果表明，虽然大鼠在慢性应激的不同时间点其游离睾酮与总睾酮总是存在线性相关关系，但其斜率是不同的。随着应激时间的不断增加，大鼠游离睾酮与总睾酮的比值呈现逐渐下降的趋势。到应激第3、4周时该值几乎达到运动性疲劳组的水平。提示在运动和慢性应激条件下，大鼠游离睾酮水平的下降幅度较总睾酮大。

睾酮主要由睾丸的间质细胞合成，肾上腺皮质的网状带和卵巢也能分泌少量的睾酮。睾酮的主要作用是促进和维持第二性征，促进蛋白质的合成和组织的修复。在体内睾酮以结合和游离两种状态存在，大约60%的睾酮与性激素结合球蛋白结合，其余与白蛋白结合，而只有1% ～2%处于游离状态。除游离睾酮外，与白蛋白结合的睾酮也可能具有生物活性，而性激素结合球蛋白则能够抑制睾酮的活性。有研究发现长时间力竭性运动甚至可以使男运动员的血睾酮降至正常女性水平［6］。一次运动引起的血睾酮浓度下降可以很快恢复，一般为几个小时或几天。但如果长期高强度训练，血睾酮较难恢复。因此，低睾酮水平与运动性疲劳状态相关。最新的一项研究，表明在健康老年男性中，低游离睾酮水平提示体质比较脆弱［7］。本研究结果中慢性应激可以使大鼠体内睾酮水平的降低达到中枢性运动性时的水平。提示慢性应激可以导致大鼠长时间处于躯体疲劳状态，并可能导致体质的下降。

本研究中不可预测慢性应激使大鼠的睾酮水平降低的原因可能为，在慢性应激条件下大鼠下丘脑－垂体－肾上腺(HPA)轴功能应激性亢进与下丘脑－垂体－性腺(HPG)轴功能应激降低密切相关。应激反应时，下丘脑促肾上腺皮质释放激素(CRF)及肾上腺糖皮质激素(GCS)大量释放，CRF和 GCS均可在下丘脑、垂体、性腺(睾丸或卵巢)多水平抑制 HPG轴功能［8－11］。最近研究发现，在加速衰老的大鼠模型中，其体内睾酮水平明显降低，同时反映其活力指标的不活动的时间出现了明显的延长［12］。52%的恶性肿瘤患者具有中－重度疲劳感，其中42.4%的女性和65.5%的男性脱氢表雄酮的水平偏低［13］这些证据说明睾酮水平与疲劳感之间存在着密切的关系。

到目前，虽然慢性疲劳综合征病因和发病机制尚未阐明，但普遍认为其发病与长期应激相关。本研究中发现大鼠经慢性应激导致疲劳状态时，其体内睾酮水平降低，这种改变以游离睾酮与总睾酮比值的形式变化最直接和可靠，能够最大限度的避免个体差异。如我们将这一检测手段用来研究长期处于高度应激状况下人群的睾酮水平变化，则有可能寻找到诊断慢性疲劳综合征的生物化学指标。

(致谢:清华大学医学院神经工程研究所洪波老师，梁惠施同学;首都医科大学化学生物学与药学院李宇航老师;首都医科大学实验动物科学部乔欣老师在本研究中给予了大量帮助，在此表示真诚的感谢!)

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Testosterone Level Decreases in Chronic Stress Rats

LIU Zhan－dong1，BAO Xiao－li2，ZHANG Jin－lu3，LIU Tian－hui2，ZHAO Huan－ying3，ZHAO Jun－peng3，CHEN Jun1，ZHAO Yuan1，ZHAO Hong1，WANG De－xin1
(1.Department of Neurology;2.Liver Research Center，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China;3.Beijing Institute for Neuroscience，Capital Medical University，Beijing，100067)

ObjectiveTo investigate the serum testosterone variation and its relevance to fatigue by a comparison of the serum testosterone levels in chronic stress rat model and athletic fatigue rat model.MethodsTo establish a chronic stress rat model and an athletic fatigue model，to monitor the rat activity capacity with a rat movement tracing device and to detect the serum total testosterone(TT)level and serous free testosterone(FT)level using radio－immunological methods.ResultsThe total activity capacity(referring to the length of rat movement track)of chronic stress rats increased(P＜0.01)compared with control in the first week.However，the chronic stress rats had lower total activity capacity than the control group(P＜0.01).The serum free testosterone(FT)level was linearly correlated with the total testosterone level in all groups.With the prolongation of stress，the FT/TT ratio in four week chronic stress group decreased to the same level in the athletic group.ConclusionChronic stress caused significant decrease in rat serum testosterone level，suggesting that it is applicable to quantify the biochemical parameters for the diagnosis of chronic fatigue syndrome(CFS)with dynamic tracing method and stratified evaluation of serum FT and TT in CFS patients.The FT/TT ratio proves to be a relaible indicator of male hormones，and may well reflect the physiological influence of interventional factors.

Chronic stress;Fatigue;Testosterone;Chronic fatigue syndrome;Rat

R872.7

A

1005－4847(2010)06－0526－04

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.06.017

2010－05－10

首都医科大学基础临床合作课题 (编号:10JL33)。

刘占东(1971－)，男，医学博士，副主任医师。研究方向:神经系统常见疾病的神经生物化学领域，对于慢性疲劳综合征有较为深入的研究。E－mail:Zhandongliu@hotmail.com