动态观察姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠尿液AD7C－NTP浓度的影响

李瑞晟，李勇，王虹，任映，朱志慧，孙海芸，杨金铎，王蓬文

(北京中医药大学东直门医院中药药理学实验室，北京 100700)

动态观察姜黄素对APP/PS1双转基因小鼠尿液AD7C－NTP浓度的影响

李瑞晟，李勇，王虹，任映，朱志慧，孙海芸，杨金铎，王蓬文

(北京中医药大学东直门医院中药药理学实验室，北京 100700)

目的 通过动态检测小鼠尿液中AD7C－NTP的浓度变化，了解姜黄素在阿尔茨海默病治疗方面的作用。方法 3月龄APP/PS1双转基因小鼠35只，随机分为5组，每组7只，分别为模型组，阳性对照组(罗格列酮组)，姜黄素大、中、小剂量组;另选用同月龄同背景的C57BL/6J小鼠7只作为正常对照组。以上6组连续灌胃3个月，分别于灌胃前、灌胃30 d、灌胃60 d和灌胃90 d收集小鼠尿液，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测尿AD7C－NTP浓度的变化。结果 不同时间点各组小鼠尿AD7C－NTP浓度的动态存在波动，各治疗组治疗2个月与治疗1个月相比，AD7C－NTP浓度均有所下降(P＜0.05，P＜0.01);同一时间点小鼠尿 AD7C－NTP浓度组间比较:治疗2个月后，西药组，姜黄素大、小剂量组与模型组相比AD7C－NTP浓度有所下降(P＜0.05，P＜0.01)。结论姜黄素可降低AD模型小鼠尿液内AD7C－NTP浓度，延缓AD的进展。

姜黄素;APP/PS1双转基因小鼠;AD7C－NTP;阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种以隐匿起病和进行性认知功能损害为特征的神经变性病，目前西医用于AD治疗的主要药物多限于对症治疗，而对AD的病理进程影响较小，并且较大的毒副作用限制了其广泛应用。近年来，国内外临床和实验研究表明，中药单体姜黄素(curcumin)具有广泛的药理作用，部分研究结果表明其在改善AD认知功能，减轻炎性反应及抗氧化损伤等方面都具有良好效果［1］。尽管已证实姜黄素具有多种功效，但其药物作用机制却始终没有定论。在一项筛查疑似AD患者的临床试验中，阿尔茨海默相关的神经丝蛋白(Alzheimer－associated neuronal thread protein，AD7c－NTP)含量检测被认为是确诊 AD的有效指标，符合率达91.4%［2］。另有文献报道噻唑烷二酮类抗糖尿病药物罗格列酮，能够改善AD的认知功能［3］，同时也有结果显示中枢神经系统内神经元富含的胰岛素受体和胰岛素样生长因子1极易被AD7C－NTP 损伤［4］。基于上述观点，我们采用罗格列酮作为阳性对照组并选取AD7c－NTP作为研究指标，从 AD模型 APP/PS1双转基因小鼠的尿液AD7c－NTP浓度动态变化出发，动态观察不同时间、不同剂量姜黄素对AD的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3月龄APP/PS1双转基因小鼠及同月龄同背景的 C57BL/6J正常小鼠，体质量22～25 g，购自中国医学科学院实验动物研究所［SCXK(京)2009－0004］。小鼠饲养和实验均在屏障环境动物实验室内进行【SYXK(京)2004－2009】。小鼠饲料为清洁级维持鼠料，由北京科澳协力饲料有限公司供给【SCXK(京)2005－0007】。小鼠垫料为消毒垫料，由中国医学科学院实验动物研究所提供。饮用水为消毒水。

1.2 药物与试剂

姜黄素为美国 Sigma－Aldrich公司产品，批号为c1386;马来酸罗格列酮片为葛兰素史克(天津)有限公司产品，批号为09060108;羧甲基纤维素钠(carboxymethyl cellulose，CMC)为北京精求化工有限责任公司，批号为3405005;用前配制成 0.5%4℃冰箱储存;AD7C－NTP检测试剂盒来自深圳市安群生物工程有限公司，批号为20091115。

1.3 仪器

CB－128C酶标仪(中国香港);赛多利斯电子天平 BS124S(德国)。

1.4 灌胃药物配制

1.4.1 姜黄素大、中、小剂量:用精密天平称取姜黄素 2.40、1.20和 0.60 g，分别溶于 60 mL 0.5%CMC中，摇匀后置100 mL棕色瓶中4℃冰箱储存，配好后的溶液浓度分别为40、20、10 mg/mL。

1.4.2 阳性对照组(罗格列酮组):取罗格列酮(每片含原药4 mg)15片，碾成粉末后溶于60 mL 0.5%CMC中，摇匀后置100 mL棕色瓶中4℃冰箱储存，配好后的溶液浓度为1 mg/mL;正常对照组及模型组:60 mL 0.5%CMC，置100 mL棕色瓶中4℃冰箱储存。以上灌胃药物每15d配制1次，共需配制6次。

1.5 分组与给药

3月龄APP/PS1双转基因小鼠35只，随机分为5组，每组7只。①阳性对照组:罗格列酮10 mg/(kg·d)灌胃;②姜黄素大剂量组:姜黄素400 mg/(kg·d)灌胃;③姜黄素中剂量组:姜黄素200 mg/(kg·d)灌胃;④姜黄素小剂量组:姜黄素100 mg/(kg·d)灌胃;⑤模型组:等体积0.5%羧甲基纤维素钠灌胃;⑥另设正常对照组:采用与 APP/PS1双转基因小鼠同月龄同背景的 C57BL/6J正常小鼠7只，等体积0.5%CMC灌胃。

1.6 尿液收集

所有实验动物均连续灌胃3个月，并分别于灌胃前、灌胃30 d、灌胃60 d和灌胃90 d四个时间点，采用代谢笼收集小鼠尿液。尿液收集在1.5 mL EP管中，4℃冰箱储存，在48 h内检测。

1.7 AD7C-NTP检测

采用AD7C－NTP检测试剂盒对小鼠尿液进行测定，具体步骤为:①将所需的微孔条固定于板架上，编好顺序;②在相应孔中分别加入100 μL的标准品和尿样(标准品做双孔)，空白孔不加;③用封口膜将条板封好(防止污染)，置37℃温浴60 min;④取出板条，甩干，在吸水纸上轻拍数下，每孔加入配制好的洗涤液200 ～300 μL，停留20 ～30 s，甩干，在吸水纸上轻拍数下，反复洗涤5次，在洗涤过程中应避免产生气泡;⑤每孔加入 AD7C－NTP多抗 100 μL，空白孔不加;⑥用封口膜或塑料胶条将板封好，置37℃温浴30 min;⑦反应后，再次洗涤(同4)，拍干;⑧每孔加入酶联物100 μL，空白孔不加;⑨用封口膜或塑料胶条将板封好，置37℃温浴30 min;⑩反应后，再次洗涤(同4)，拍干;○11每孔加入显色剂 A和显色剂B各50 μL或一滴，必须保证同一速度加入显色剂，中间不应有间断;○12于37℃避光显色15 min后，尽快加入50 μL或一滴终止液于各孔中;○13在酶标仪上选定450 nm波长，以空白孔调零，测定每组的吸光度值;○14根据所测得吸光度值计算相应的浓度值。

1.8 统计学处理

全部数据采用SPSS15.0软件包进行统计学处理，计量数据以(±s)表示，各组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD－t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时间点各组小鼠尿AD7C-NTP浓度的动态比较

治疗1个月后，各组小鼠尿 AD7C－NTP浓度升高，除模型组外，其余各组均与治疗前相比无统计学差异;治疗2个月与治疗1个月相比，阳性对照组(罗格列酮组)、姜黄素大、中、小剂量组均有统计学差异(P＜0.05，P＜0.01)。治疗3个月与治疗2个月相比，阳性对照组(罗格列酮组)及姜黄素大、中剂量组有统计学差异(P＜0.01)，小剂量组无差别，结果见表1(单位:ng/mL)。

表1 不同时间点各组小鼠尿AD7C－NTP浓度的动态比较(n=7，±s)Tab.1 Dynamic comparison of mice AD7C－NTP concentration in each group of mice

表1 不同时间点各组小鼠尿AD7C－NTP浓度的动态比较(n=7，±s)Tab.1 Dynamic comparison of mice AD7C－NTP concentration in each group of mice

注:与治疗前比较*P＜0.05**P＜0.01;与治疗1个月比较◆P＜0.05◆◆P＜0.01;与治疗2个月比较★P＜0.05★★P＜0.01。Note:Comparison with that before treatment*P＜0.05**P＜0.01;Comparison with that at 1 month◆P＜0.05◆◆P＜0.01;Comparison with that at 2 months★P＜0.05★★P＜0.01.

治疗3个月3 months组别Group治疗前Before treatment治疗1个月1 month治疗2个月2 months正常对照组(Normal control) 1.359±0.171 1.511±0.132 1.367±0.115 0.754±0.453 0.210阳性对照组(Positive control group) 1.579±0.319 1.671±0.183 1.358±0.056◆ 0.794±0.180★★姜黄素大剂量组(High dose curcumin) 1.578±0.227 1.876±0.277 1.353±0.196◆ 0.764±0.212★★姜黄素中剂量组(Medium dose curcumin) 1.695±0.184 1.832±0.232 1.481±0.171◆ 0.853±0.179★★姜黄素小剂量组(Low dose curcumin) 1.646±0.147 1.837±0.352 1.342±0.145**◆◆ 1.048±0.281模型组(Model) 1.496±0.100 1.919±0.702 1.409±0.156 1.180±

2.2 同一时间点小鼠尿AD7C-NTP浓度组间比较

2.2.1 治疗前:阳性对照组(罗格列酮组)，姜黄素大、中、小剂量组与模型组相比无统计学差异。阳性对照组(罗格列酮组)，姜黄素中、小剂量组与正常对照组有统计学差异(P＜0.05，P＜0.01)。

2.2.2 治疗1个月后:各组小鼠尿AD7C－NTP浓度升高，但阳性对照组(罗格列酮组)，姜黄素大、中、小剂量组与模型组，正常对照组相比均无统计学差异。

2.2.3 治疗2个月后:西药组、姜黄素大、小剂量组与模型组相比有统计学差异(P＜0.05，P＜0.01)。治疗3个月后，正常对照组、阳性对照组(罗格列酮组)、姜黄素大、中剂量组与模型组相比有统计学差异(P＜0.05，P＜0.01)，阳性对照组(罗格列酮组)与模型组相比有统计学差异(P＜0.05)，姜黄素小剂量组与正常对照组相比有统计学差异(P＜0.05)，结果见表2(单位:ng/mL)。

表2 同一时间点小鼠尿AD7C－NTP浓度组间比较(n=7，±s)Tab.2 Comparison of AD7C－NTP concentration at the same time point among different groups

表2 同一时间点小鼠尿AD7C－NTP浓度组间比较(n=7，±s)Tab.2 Comparison of AD7C－NTP concentration at the same time point among different groups

注:与正常对照组比较ΔP＜0.05ΔΔP＜0.01;与模型组比较 ▲P＜0.05▲▲P＜0.01;与西药组比较◇P＜0.05◇◇P＜0.01。Note:Comparison with the normal controlΔP＜0.05，ΔΔP ＜0.01;Comparison with the model group▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;Comparison with the western medicine－treated group◇P ＜0.05，◇◇P ＜0.01。

治疗3个月3 months正常对照组 Normal control 1.359±0.171 1.511±0.132 1.367±0.115▲ 0.754±0.210组别Group治疗前Before treatment治疗1个月1 month治疗2个月2 months▲▲阳性对照组(Positive control group) 1.579±0.319Δ 1.671±0.183 1.358±0.056▲ 0.794±0.180▲姜黄素大剂量组(High dose curcumin) 1.578±0.227 1.876±0.277 1.353±0.196▲ 0.764±0.212▲▲姜黄素中剂量组(Medium dose curcumin) 1.695±0.184ΔΔ 1.832±0.232 1.481±0.171 0.853±0.179▲姜黄素小剂量组(Low dose curcumin) 1.646±0.147Δ 1.837±0.352 1.342±0.145▲▲ 1.048±0.281Δ模型组(Model) 1.496±0.100 1.919±0.702Δ 1.409±0.156Δ 1.180±0.453ΔΔ◇

3 讨论

对于AD的研究，主要集中在以下三个方面，即发病机制、早期诊断和药物治疗。AD的机制复杂且不明确，存在许多不同假说，近年来有研究显示，受损的胰岛素信号转导通路可能是介导AD发病的共同通路［5］。本实验研究也发现，采用小鼠尿AD7C－NTP作为观察指标，发现阳性治疗组(罗格列酮)与姜黄素治疗各组在降低AD7C－NTP浓度方面没有差异(P＞0.05)，而姜黄素是否也是通过改善受损胰岛素通路发挥作用还有待后续研究探索。

对于AD的早期诊断，目前还缺乏简便、高效及廉价的检测指标以及合适的筛查人群，因此如何对早期AD患者进行简便有效的筛查也是AD研究的重点。为此本实验选取 AD7C－NTP作为早期诊断AD的实验指标，以双转基因小鼠作为研究对象。

AD7c－NTP属神经丝蛋白家族，在早期AD患者的脑组织、脑脊液和尿液中就有升高，并且其含量与痴呆的严重程度呈正比，是对AD敏感性及特异性均较高的蛋白指标［6］，尤其是尿液检测，实验标本易于获得，检测效果较好。而作为模型动物的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠，表达突变人 β－淀粉样前体蛋白基因 swe(β－amyloid precursor protein，APPswe)和突变早老蛋白 1－A246基因 (presenilin 1，PS 1－246E)，可在短 期 内 大 量 产 生 Aβ1－42 及ADDLs，出现拟AD的病理改变，随年龄的增加这些病理改变会逐渐加重［7］，是公认的研究 AD的防治策略的转基因动物模型。

对于中晚期AD的治疗，西药毒副作用较大，长期用药疗效欠佳。而对于早期 AD，由于诊断的滞后性，往往错过了最佳的药物治疗时间。因此开发具有能够早期干预AD的药物是目前临床亟待解决的难题。中药单体姜黄素是从姜黄属中药姜黄、郁金、莪术等的根茎中提取出来的酚类色素［8］，体外研究显示姜黄素具有抗Aβ聚集的作用，可抑制Aβ聚集，使已聚集的 Aβ解聚，防止 Aβ42寡聚体的形成和毒性［9，10］。另外姜黄素可减少 Aβ诱导的抗氧化酶水平升高，DNA损伤，tau蛋白过磷酸化和炎症反应［11］;体内研究显示口服姜黄素可抑制Tg2576AD模型小鼠脑内炎症和氧化反应，抑制Aβ寡聚体形成和Aβ沉积，降低磷酸化tau和磷酸化胰岛素受体底物(IRS－1)水平，改善 Y迷宫的行为学缺陷［12］。本实验中我们也观察到，随着治疗时间的增加，中药单体姜黄素能够显著降低AD模型小鼠尿中AD7C－NTP的含量，表明姜黄素可影响 AD模型动物的疾病进展。另外在实验中还存在一些现象，如在灌胃治疗1个月后，各组小鼠的尿 AD7CNTP浓度均有不同程度的升高，这可能是由于AD模型动物疾病进展较快，治疗还没有完全发挥作用所致。值得注意的是，实验中模型组小鼠尿AD7CNTP浓度在灌胃第3个月时出现下降，但与治疗前、治疗1个月及治疗2个月相比无差异(P＞0.05)，且与同一时间点各治疗组相比浓度仍较高，推测尿液中AD7C－NTP的浓度可能在AD疾病发展过程中存在波动。而出现上述情况的具体原因还有待进一步延长实验时间来证实。

［1］ 李勇，王蓬文.姜黄素神经保护作用研究概况［J］.中国中药杂志，2009，34(24):3173－3175.

［2］ Goodman I，Golden G，Flitman S，et al.A multi－center blinded prospective study of urine neural thread protein measurements in patients with suspected Alzheimer′s disease［J］.AMDA，2007，8(1):21－30.

［3］ Deighan DJ， Clarke BF， Griffin RM， et al. Interleukin－4 mediates the neuroprotective effects of rosiglitazone in the aged brain［J］.Neurobiol Aging，2009，30(6):920－ 931.

［4］ de la Monte SM，Wands JR.Alzheimer－associated neuronal thread protein mediated cell death is linked to impaired insulin signaling［J］.Alzheimers Dis，2004，6(3):231－242.

［5］ Deng YQ，Li B，Liu Y，et al.Dysregulation of insulin signaling，glucose transporters，O－GlcNAcylation，and phosphorylation of Tau and neurofilaments in the brain［J］.Am J Pathol，2009，175(5):2089－2098.

［6］ 王宏娟，王蓉.AD7c－NTP—一种阿尔茨海默病的生物标记物［J］.中国老年学杂志，2007，4(27):699－701.

［7］ Sylvia E，Perez，Saleem Dar， et al.Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1dE9 transgenic mouse［J］.Neurobiol Dis，2007，28(1):3－15.

［8］ Begum AN，Jones MR，Lim GP，et al.Curcumin structurefunction， bioavailability， and efficacy in models of neuroinflammation and Alzhermer’s disease［J］.Pharmacol Exp Ther，2008，326(1):196－208.

［9］ Savonenko A，Xu GM， Melnikova T，et al.Episodic－like memorydeficitsin the APPswe/PS1dE9 mouse modelof Alzheimer＇s disease:relationships to beta－amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities［J］.Neurobiol Dis.2005，18(3):602－617.

［10］ Ono K，Hasegawa K，Naiki H，et al.Curcumin has potent antiamyloidogenic effects for Alzheimer’s beta－amyloid fibrils in vitro［J］.Neurosci Res.2004，75:742－750.

［11］ Sikora E，Bielak－Zmijewska A，Mosieniak G，et al.The promise of slow down ageing may come from curcumin［J］.Curr Pharm Design，2010，16(7):884－892.

［12］ Ma QL，Yang F，Rosario ER，et al.Beta－amyloid oligomers induce phosphorylation of tau and inactivation of insulin receptor substrate via c－Jun N－terminal kinase signaling:Suppression by omega－3 fatty acids and curcumin［J］.Neurosci，2009，29:9078－9089.

Effect of Curcumin on Urine Concentration of AD7C-NTP in APP/PS1 Double Transgenic Mice

LI Rui－sheng，LI Yong，WANG Hong，REN Ying，ZHU Zhi－hui，SUN Hai－yun，YANG Jin－duo，WANG Peng－wen
(The Herbal Pharmacology Laboratory，Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China)

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of curcumin on Alzheimer's disease by dynamical detection of the changes of the concentration of Alzheimer－associated neuronal thread protein(AD7C－NTP)in mouse urine.MethodsA total of 35 three－month－old APP/PS1 double transgenic mice were randomized into 5 groups(n=7):model group，positive control group(rosiglitazone)，high，medium and low dose curcumin groups.C57BL/6J mice in the same age and genetic background as APP/PS1 double transgenic mice were used as normal control group(n=7).All the 6 groups of mice were intragastrically administered for 3 consecutive months.Urine samples were collected on the day before，and 30，60 and 90 days after intragastric administration，respectively.The changes of urinary AD7c－NTP concentration was detected by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsComparison of the AD7C－NTP concentrations in each group of mice:The AD7C－NTP concentration in the positive control group，high，medium and low dose curcumin groups at 60 days time point was significantly decreased than that at 30 days time point(P ＜0.05，P ＜0.01).Comparison of AD7C－NTP concentrations at the same time point among different groups:compared with the model group，the AD7C－NTP concentration of positive control group，high and low dose curcumin groups was significantly deceased after 2－month treatment(P ＜ 0.05，P ＜ 0.01).ConclusionCurcumin can decrease urinary AD7C－NTP concentration in AD model mice and delay progression of Alzheimer’s disease.

Curcumin;APP/PS1 double transgenic mouse;AD7C－NTP;Alzheimer's disease

Q95－3，R－332

A

1005－4847(2010)05－0406－04

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.05.10

2010－02－24

北京市自然基金资助项目(No.7092057);高等学校学科创新引智基地(111计划)教育部和国家外国专家局［B08006］资助项目。

李瑞晟(1982－)，男，在读硕士研究生，中药药理研究方向。

王蓬文，女，教授，主要从事神经元变性病的发病机制及防治对策研究。