博来霉素诱导G57BL/6与ICR小鼠肺间质纤维化模型的比较

宋淑范，张晓晔

(中国医科大学附属盛京医院第二肿瘤科，沈阳 110004)

研究报告

博来霉素诱导G57BL/6与ICR小鼠肺间质纤维化模型的比较

宋淑范，张晓晔

(中国医科大学附属盛京医院第二肿瘤科，沈阳 110004)

目的探讨C57BL/6与ICR小鼠在博来霉素(BLM)致肺纤维化过程中的种属差异。方法8周龄雌性C57BL/6小鼠19只，ICR小鼠16只，分别经尾静脉一次性注射BLM 150 mg/kg，观察每组小鼠体重、生存率及肺组织病理改变。结果①C57BL/6与ICR小鼠最低体重分别发生在静脉注射处置后的7 d和5 d，最低体重分别为注射前的65.46%和73.21%，两组间无显著的统计学差异。②C57BL/6与ICR小鼠的生存率分别为36.84%和56.25%，两组间存在显著的统计学差异。③C57BL/6小鼠BLM注射后28 d，在胸膜下及血管周围形成广泛、稳定的间质纤维化病理改变，而ICR小鼠肺组织未见明显纤维化形成。C57BL/6小鼠肺纤维化病理评分明显高于ICR小鼠(P＜0.001)。结论BLM诱导的肺纤维化作用在C57BL/6与ICR小鼠间存在着明显的种属差异。C57BL/6小鼠较ICR小鼠更适于复制博来霉素诱导的肺纤维化动物模型。

小鼠;近交C57BL/6;近交ICR;博来霉素;肺纤维化

特发性肺间质纤维化(IPF)的发病机制仍不清楚，对其机制的研究和实验性治疗，多依赖于动物模型。BLM是一种细胞毒性药物，具有致肺纤维化的作用，目前广泛用于建立肺纤维化动物模型。不同种属的动物对BLM致肺纤维化作用的反应不同［1，2］，为建立肺间质纤维化的动物模型，我们比较了静脉注射BLM在C57BL/6和ICR小鼠形成肺间质纤维化的种属差异。

C57BL/6小鼠是立特(Little)于1921年用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL，1937年从C57BL分离出C57BL/6亚系，是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究中常用的品系。ICR小鼠是Hauschka用Swiss小鼠群以多产为目标，进行选育，以后美国癌症研究所分送各国饲养实验，各国称为ICR小鼠。我们在研究中发现，静脉注射BLM对C57BL/6小鼠与ICR小鼠肺组织损伤和间质纤维化形成的作用有明显差别。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物的购置与饲养:C57BL/6小鼠，雌性、8周龄、体质量17～20 g;ICR小鼠，雌性、8周龄、体质量32～35 g，均购于日本SLC株式会社。用可屏除抗原的过滤箱邮送，饲养于清洁级动物实验室。

1.1.2 实验动物处理:35只小鼠在动物实验室内饲养一周后，C57BL/6小鼠平均体质量(17.44± 0.57)g，ICR小鼠平均体质量(33.41±0.96)g，分别经尾静脉注射盐酸BLM(日本化药株式会社，制造号:381480。溶于0.9%NaCl 200μL)150 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 实验动物的观察及标本的采集:每日am 10.00，称量小鼠体重，并观察死亡情况。

1.2.2 肺组织病理检查:小鼠尾静脉注射处置后28 d，每组取5只小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉放血处死，开胸，向左肺灌注4%甲醛，直至肺表面平滑，结扎左支气管，取出左肺，放入4%甲醛中固定。石蜡包埋，切片(4 μm)行Masson's trichrome染色。

1.2.3 肺组织病理评分:利用Ashcroft［3］的方法，进行肺纤维化严重度的形态学半定量分析［4］。简言之，将肺组织病理由0(正常组织)至6(最严重的纤维化病变)分7个等级，每只小鼠随机取5个肺组织HE染色片，每片在100倍视野下，观察30个连续视野，其平均值为该鼠纤维化的等级评分。两位观察者双盲观察评分的平均值，作为纤维化等级的最终得分。

2 结果

2.1 两组小鼠体重变化

C57BL/6小鼠在第7天、ICR小鼠在第5天时体重降至最低，分别为(11.41±1.57)g和(24.46 ±1.67)g，分别是静脉注射BLM前体重的65.46%和73.21%。两组小鼠最低体重均较BLM注射前显著降低(P＜0.001)。见图1。

DMEM高糖培养基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国Hyclone公司，重组人血管内皮抑制素注射液(15 mg/3 mL)购自山东先声麦得津生物制药有限公司，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)染色剂购自武汉博士德公司，DDP注射液(10 mg/2 mL)购自云南个旧生物药业有限公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天公司。

注:C57BL/6小鼠在第7天、ICR小鼠在第5天时体重降至最低，与第1天小鼠体重比较，体重均明显减轻(**:与第一天比较，P＜0.001)。图1两组小鼠体重变化曲线Note:After intravenous injection of bleomycin，both the C57BL/6 and ICR mice show weight loss gradually，reaching a maximum at the 7 th and the 5 th day，respectively.(**: compare with the first day，P＜0.001)Fig.1 The curves of body weight changes in the two groups

2.2 两组小鼠生存率比较

尾静脉注射处置后，C57BL/6小鼠于第7天、ICR小鼠于第11天开始出现死亡，第16天后两组均无死亡发生，C57BL/6小鼠与ICR小鼠的生存率分别为36.84%和56.25%，两组间有显著的统计学差异(P＜0.001)。

2.3 小鼠肺组织病理学改变

C57BL/6组小鼠第28天在胸膜下及血管周围可见多处肺泡结构消失，肺实质呈大片融合实变，其间有大量炎症细胞浸润，形成广泛、稳定的纤维化(图2)。ICR组小鼠肺组织病理未见明显纤维化改变(图3)。图2，3见彩插2。

2.4 两组小鼠肺组织病理评分

C57BL/6组与ICR组小鼠尾静脉注射处置后第28天，肺组织纤维化病理评分分别为(5.4± 0.25)和(1.0±0.08)，C57BL/6组小鼠显著高于ICR组小鼠(P＜0.001)。

3 讨论

至今为止，IPF的发病机制仍不十分清楚，对其机制的研究，目前常利用BLM复制的肺间质纤维化动物模型，C57BL/6及ICR小鼠均对BLM致肺纤维化作用敏感，均可用于制作肺间质纤维化动物模型［1，2，5］。经气管滴入BLM虽是目前常用的肺纤维化动物模型复制方法［6］，但该方法需进行气管切开，操作比较复杂，且存在一定的感染风险。经尾静脉注射BLM亦可制作肺间质纤维动物模型，该方法操作简单，需时短，并可避免由于手术操作而引发的感染。

我们的结果显示，尾静脉注射BLM(150 mg/ kg)后第28天，C57BL/6小鼠肺间质形成了大片纤维化病理改变，而ICR小鼠肺组织未见明显病理改变，其纤维化病理评分分别为(5.4±0.25)和(1± 0.08)(P＜0.001)。提示静脉注射BLM后C57BL/ 6较ICR小鼠更易形成肺间质纤维化。

ICR小鼠在静脉注射150 mg/kg的BLM后，未形成肺间质纤维化改变，推测可能与注射剂量较小有关，因同样剂量BLM注射后，C57BL/6小鼠生存率为36.84%，而ICR小鼠的生存率为56.25%，明显高于C57BL/6小鼠，说明ICR小鼠对BLM的耐受性明显高于C57BL/6小鼠。Li等［7］应用100 mg/ kg的BLM静脉注射成功复制了ICR小鼠肺纤维化的动物模型，这与我们在剂量上存在着较大的差别，推测可能与用药的药物活性和小鼠的亚种，以及小鼠的周龄不同有关。刘珊等［8］以6 mg/kg的BLM通过气管内给药成功复制了ICR小鼠肺纤维化的动物模型。这都说明ICR小鼠亦可用于肺间质纤维化动物模型的复制。

虽然C57BL/6小鼠体重明显较ICR小鼠轻，会给一些需要更大质量肺组织的研究带来不便，但由于C57BL/6较ICR小鼠更易形成肺间质纤维化，因而如果不需要更大质量的组织，我们建议使用C57BL/6小鼠来复制小鼠肺间质纤维化动物模型。

利用尾静脉注射BLM的方法制作肺间质纤维化动物模型，其肺病理改变主要分布于胸膜下及血管周围，这与临床IPF病理分布更为接近，因而建议在科研中尽量应用该方法来进行肺间质纤维化的研究。

(本文图2，3见彩插2。)

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Com parison of the Effects of Bleom ycin on the Induction of Pu lm onary Fibrosis in C57BL/6 and ICR M ice

SONG Shu－fan，ZHANG Xiao－ye
(The Second Department of Oncology，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110021，China)

ObjectiveTo investigate the species differences between C57BL/6 and ICR m ice in the establishment of models of pulmonary fibrosis induced by bleomycin(BLM).M ethods The experiment was carried out in 19 8－week old female C57BL/6 and 16 8－week old female ICR mice by injection of 150 mg/kg BLM via the tail vein，and the mice were killed at 4 weeks after BLM injection.The body weight，survival rate，and histological changes of the lungs in each group were examined.Results①The lowest weight of the C57BL/6 m ice occurred on the 7 th day and was 65.46%of their original weight before BLM injection，and that in the ICR mice was 73.21%at the 5th day，with a nonsignificant difference between the two groups.②The survival rate of the C57BL/6 mice was 36.84%，and the ICR m ice was 56.25%，with a significant difference between the two groups.③Pulmonary interstitial fibrosis was widely and stably formed under the pleura and around the vasculature，in C57BL/6 mice at the 28th day after BLM administration，but no significant fibrosis formed in the ICR mice.Compared with the ICR mice，the pathologic scores of the pulmonary fibrosis in C57BL/6 mice was significantly higher(P＜0.001).ConlusionThe effect of bleomycin in the induction of pulmonary fibrosis in C57BL/6 and ICR mice shows a distinct species differences.C57BL/6 mouse is more suitable for the preparation of pulmonary fibrosis models induced by BLM.

C57BL/6 mouse;ICR mouse;Bleomycin;Pulmonary fibrosis

R361

A

1005－4847(2010)04－0289－03

2009－12－30

国家自然科学基金资助项目(30100076;30570812);辽宁省自然科学基金资助项目(20042085)基金资助。

宋淑范(1981－)，女，硕士研究生，研究方向:肺间质纤维化。

张晓晔，E－mail:zh_yd@126.com