东方田鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系的建立

成钢，罗赛群，盖楠，熊德慧，李荣，胡维新

(中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心，长沙 410078)

研究报告

东方田鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系的建立

成钢，罗赛群，盖楠，熊德慧，李荣，胡维新

(中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心，长沙 410078)

目的建立东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系，为全面研究东方田鼠抗日本血吸虫机制以及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定基础和提供细胞实验材料。方法运用脂质体介导的基因转染法将pSV3 neo质粒导入第3代东方田鼠胚胎成纤维细胞，经G418筛选抗性克隆并扩大培养，建立永生化细胞系;用PCR检测细胞株中SV40T基因的整合，RT－PCR鉴定SV40T基因在转染细胞中的表达;绘制东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞生长曲线。结果阳性细胞克隆已扩大培养并稳定传代50代，经鉴定SV40 T抗原已整合到东方田鼠胚胎成纤维细胞中且稳定表达。结论成功建立东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系。

东方田鼠;胚胎成纤维细胞;永生化;SV40T抗原

东方田鼠(M icrotus fortis，M f)是一种栖居于我国长江流域的啮齿类动物，流行病学调查和人工感染实验均证明其对日本血吸虫感染具有天然抗性，且这种抗性能稳定遗传［1］。我们前期实验已对M f胚胎成纤维细胞(Microtus fortis embryonic fibroblasts，M fEF)成功培养并进行了相关生物学特性观察。建立永生化M f胚胎成纤维细胞系，是M f实现实验动物化，标准化，规范化的重要基础，也是研究M f发挥抗日本血吸虫作用的重要试验材料。目前，已建立多种人和小鼠胚胎成纤维细胞系，M fEF的永生化细胞系尚为首次报道。近年来，许多研究应用病毒基因的转染使细胞永生化，为细胞的长期培养和功能研究提供了理想的方法和手段［2，3］。本研究采用脂质体介导的基因转染法，将质粒pSV3 neo(含有SV40 T抗原基因和neo抗性基因)转染第3代M fEF，旨在使其永生化，为M fEF长期培养和全面研究东方田鼠抗日本血吸虫机制以及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定基础和提供细胞实验材料。

1 材料与方法

1.1 主要材料

20周龄，体质量70～80 g的怀孕东方田鼠(长江亚种人工封闭繁育第3代)由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供。质粒pSV3 neo系中南大学湘雅医学院病理生理学教研室惠赠;Taq DNA聚合酶、Hind III、EcoR I、marker均购自日本TaKaRa公司，质粒抽提试剂盒购自安比奥生物技术有限公司，新生小牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司; Lipofectam ineTM2000，购自Invitrogen Life Technologies公司;DMEM培养基、胰蛋白酶、G418及Trizol购自美国Gibco公司;其余常用试剂均为国产分析纯。PCR引物由上海英俊生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 东方田鼠胚胎成纤维细胞的原代培养:取妊娠12～13 d的孕鼠，乙醚麻醉后无菌取出子宫，用PBS漂洗3次，弃除表面血污，剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，用镊子撕破胎膜，取出胎鼠，剔除胎盘、胚头、内脏和四肢，无菌PBS漂洗3次，剔除可能附带的脂肪组织、被膜结缔组织、坏死组织以及红细胞，将鼠胚躯干剪成约1 mm3的碎块，放入离心管后用培养液反复吹打，静置沉淀5 min，吸取上清于培养瓶内，在含15%FBS、100 U/m L青霉素、100 U/ m L链霉素的DMEM，37℃，5%CO2条件下培养［4］。

1.2.2 质粒pSV3 neo的扩增与转染:质粒pSV3 neo提取、鉴定均按试剂盒操作说明进行。根据Invitrogenlife technologies公司提供的转染操作说明书进行基因转染:第3代M fEF细胞融合率达到70%～80%时，用无血清无抗生素DMEM培养基分别将8～10 μg pSV3 neo质粒DNA和15～20 μL脂质体试剂稀释至500 μL;将稀释的DNA与脂质体混合，室温静置20 min。M fEF用无血清DMEM培养基洗涤两遍后，加入上述1 m L质粒与脂质体的混合物，于37℃，5%CO2的培养箱孵育6～12 h，即完成转染过程。

1.2.3 转染阳性克隆细胞的筛选及扩大培养:转染完成后更换普通培养基，将细胞接种于六孔板，24～48 h后更换含800 μg/m L G418的培养基开始筛选。阳性细胞克隆生长至一定数目后扩增培养。细胞的换液、传代、冻存及复苏按常规方法进行，复苏后台盼蓝染色，计算细胞存活率。

1.2.4 SV40T基因在永生化细胞中的整合及表达:①PCR扩增:收集第5代和第20代细胞样品，提取培养细胞的基因组DNA。根据SV40大T抗原基因序列设计引物，上游，5′－TGTGGTATGGCTGATT ATGA－3′;下游，5′－CGCAGTGAGTTTTTGTTAGA－3′，扩增产物为391 bp。反应条件:95℃预变性4 m in，然后95℃30 s，56℃30 s，72℃60 s，30个循环，72℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析。②RT－PCR分析:按Trizol试剂盒操作法提取培养细胞的RNA，进行逆转录。SV40大T抗原基因引物序列及大小同上。内参引物为β－actin，上游引物:5′－GTGGGAATTCGTCAGAAGGACTCCTATG TG－3′，下游引物:5′－GAAGTCTAGAGCAACATAGC ACAGCTTCTC－3′，扩增产物为260 bp，反应条件同上，PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.5 未转染和转染后M fEF生长情况比较:取未转染的第3代M fEF和转染后第15代M fEF分别接种至48孔板，每孔接种10 000个细胞，每种浓度重复三孔，用血球计数板每天计数取平均值，连续7 d，绘制细胞生长标准曲线。

2 结果

2.1 永生化M fEF的生物学性状

倒置显微镜观察:刚传代接种的单个M fEF呈球形，悬浮于培养液中，胞质透明，1～2 h后开始贴壁，细胞呈纤维状生长，表面颗粒少，胞质饱满，轮廓清晰且细胞增殖较快，培养24～48 h可长满瓶底(图1，彩插3);永生化M fEF与原代M fEF相比，可见较多的细胞分裂相和增殖细胞，在形态结构上与原代细胞无明显差异，细胞传代后贴壁速度较原代细胞稍慢。

2.2 质粒pSV3 neo酶切鉴定

质粒pSV3 neo经EcoR I酶切，可见8.8 kb片段，经Hind III酶切，可见4.6、3.1、1.4、0.64 kb几个片段(图2)。

2.3 永生化M f胚胎成纤维细胞系的建立

注:M.DNA marker;1.质粒pSV3neo经Hind III酶切;2.质粒pSV3neo经EcoR I酶切;3.pSV3neo质粒。图2质粒pSV3 neo酶切鉴定结果Note:M.DNA marker;1.pSV3neo plasmid digested with Hind III;2.pSV3neo plasmid digested with EcoR I;3.pSV3neo p lasmidFig.2 Restriction endonuclease digestion analysis of the p lasmids

利用脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将质粒pSV3 neo导入第3代M fEF内，经G418筛选，第6天即长出M fEF阳性克隆(图3，彩插3)。阳性克隆经扩大培养目前已稳定传代4个月，经鉴定SV40 T抗原已整合到M fEF中且稳定表达，细胞系命名为M fEF永生化细胞系。细胞按常规方法冻存，液氮冻存3个月后解冻复苏细胞接种存活率达80%以上。M fEF永生化细胞系目前已连续传代50代。

2.4 SV40 T基因在永生化细胞系中的整合及表达

对第5代和第20代M fEF永生化细胞系基因组DNA进行PCR，质粒pSV3 neo作阳性对照，产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。结果在391 bp处有一特异扩增条带，与阳性对照条带位置相同，而未转染的细胞基因组DNA中无扩增条带(图4)。

2.5 RT-PCR结果

阳性细胞在391 bp处的特异扩增条带与阳性对照条带位置相同，而未转染细胞未见该条带，内参引物为β－actin，扩增产物为260 bp(图5)。

2.6 未转染和转染后M fEF生长情况比较

进行了永生化M fEF与非永生化M fEF生长速率间的比较，在15%血清浓度培养基中，前者在培养第2天即进入指数增长期，培养第2～4天达到生长高峰，随培养时间延长细胞逐渐衰亡，细胞生长的每一阶段特征较明显(图6)。

3 讨论

注:M.DNA marker;1.pSV3neo质粒扩增片段;2.第5代M fEF扩增片段;3.第20代M fEF扩增片段;4.未转染M fEF扩增片段图4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果Note:M.W ide range DNA ladde rmarker;1. pSV3neo p lasmid;2.The 5 th passage M fEF cells;3. The 20 th passage M fEF cells;4.untransfected cellsFig.4 Agarose gel analysis of the PCR products

注:M.DNA marker;1.阳性M fEF扩增片段;2.阴性M fEF扩增片段;3.pSV3neo质粒扩增片段图5 SV40 T抗原mRNA在M fEF中的表达Note:M.DNA marker;1.MF embryonic fibroblasts of cell clones;2.untransfected cells;3.pSV3neo plasmidFig.5 RT－PCR analysis of SV40 T antigen mRNA in the M fEF cells

前期实验结果表明:体外培养的M fEF增殖能力较弱，生长较缓慢，一般只能传代培养8～9代，极大地限制了M fEF的相关应用研究。细胞永生化是目前组织工程学领域研究的热点。SV40(sim ian virus 40)是20世纪60年代初发现并分离出的猿猴肾细胞病毒，具有转化动物细胞和诱发肿瘤的特性［5］。SV40 T基因目前被广泛用于转基因动物模型的建立和各种人类及动物细胞的永生化，SV40 T

图6 未转染和转染后M fEF生长情况比较Fig.6 Comparison of the growth of pSV3neo plasmid－transfected and nontransfected M fEF cells

抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型，可作为体外研究原始细胞的标准细胞模型［6，7］。本研究将含有SV40 T基因的质粒转染体外培养的M fEF，建立永生化细胞系，永生化M fEF与非永生化M fEF相比，可见较多的细胞分裂相和增殖细胞，细胞传代后贴壁速度较原代细胞慢;传代、冻存和复苏均不改变细胞形态和增殖能力。在实验中我们发现:永生化M fEF传代培养时对细胞密度和胰酶消化时间较敏感，如果细胞传代密度过稀，胰酶消化时间过短，则M fEF在增殖过程中会出现小囊泡状物，悬浮于培养液中，如果细胞生长过密也会出现这种情况，通过更换培养液和及时传代可消除此现象。本研究显示:利用SV40 T基因使M fEF永生化是一种可行、可重复的建系方法。M fEF永生化细胞系的建立可为M f的相关研究提供细胞、蛋白质、DNA、RNA样本，与活体样本相比，细胞系可以连续培养，反复冻存，便于管理和使用，而且不会因为个体遗传差异和生理状态影响实验的可重复性，为M fEF长期培养和全面研究东方田鼠抗日本血吸虫机制奠定了基础。

(本文图1、3见彩插3)。

［1］李浩，何艳燕，林娇娇，等.东方田鼠抗日本血吸虫现象的观察［J］.中国兽医寄生虫病，2000，8(2):12－15.

［2］陈辉，金辉，杜春艳，等.SV40T胃壁细胞定位表达转基因小鼠的建立［J］.解剖学报，2008，39(5):699－702.

［3］刘梅冬，张华莉，龚环宇，等.HSF1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞的永生化［J］.中南大学学报(医学版)2006，31(2): 174－177.

［4］成钢，盖楠，熊德慧，等.东方田鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性［J］.中国实验动物学报2010，18(3):254－257.

［5］Chen W，Hahn WC.SV40 early region oncoproteins and human cell transformation［J］.Histol Histopathol，2003，18:541－550.

［6］Poulin DL，Kung AL，Decaprio J A.p53 targets simian virus 40 large T antigen for acetylation by CBP［J］.J Virol，2004，78: 8245－8253.

［7］Sullivan CS，Baker AE，Pipas JM..Simian virus 40 infection disrupts pl30－E2F complexes but does not perturb pRbE2F complexes［J］.Virology，2004，320:218－228.

Estab lishm ent of an Imm ortalized M icrotus fortis Em bryonic Fibrob last Cell Line

CHENG Gang，LUO Sai－qun，GAI Nan，XIONG De－hui，LI Rong，HU Wei－xin
(Molecular Biology Research Center，School of Biological Science and Technology，Central South University，Changsha 410078，China)

Objective To establish an immortalized Microtus fortis embryonic fibroblast(M fEF)cell line in order to lay the foundation for further studies on M icrotus fortis against Schistosma japonicum infection and for comparative study of fibroblasts from different animals.M ethods A mammalian expression vector(pSV3 neo)containing the SV40 large T antigen was used to transfect the 3rd passage M fEF cells using LipofectamineTM2000.Colonies were screened by G418 and expanded into immortalized cell lines.PCR was used to detect the integration of the large T antigen with genome in the Microtus fortis embryonic fibroblasts.Expression of SV40 large T antigen gene in the expanded cells was identified by RTPCR.ResultsStable growth and serial propagation were observed in the immortalized M icrotus fortis embryonic fibroblast line.The mRNA of SV40 T antigen gene was expressed in cells of the immortalized cell line.ConlusionAn immortalized cell line of M icrotus fortis embryonic fibroblasts has been successfully established.

M icrotus fortis;Embryonic fibroblasts;Immortalization，SV40 T antigen

Q25

A

1005－4847(2010)04－0292－04

2010－01－08

国家自然科学基金项目(30400256);湖南省研究生科研创新项目(No.2340－74236000001)资助。

成钢(1976－)，男，讲师，博士研究生，研究方向:东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因筛选。E－mail:chenggang876@126. com。

胡维新(1950－)，男，教授，博士生导师。E－mail:weixinhu@yahoo.com.cn