D－半乳糖致亚急性衰老大鼠尿液排泄情况观察及其多尿机制探讨

谭莹，黄萍，操红缨，陈秋铃，吴清和

(1.云南省药物研究所药物安全性评价中心，昆明 650111; 2.广州中医药大学中药学院，广州 510006)

研究报告

D－半乳糖致亚急性衰老大鼠尿液排泄情况观察及其多尿机制探讨

谭莹1，黄萍2，操红缨2，陈秋铃2，吴清和2

(1.云南省药物研究所药物安全性评价中心，昆明 650111; 2.广州中医药大学中药学院，广州 510006)

目的观察D－半乳糖(D－gal)致亚急性衰老大鼠在尿液排泄方面的特点并探讨其多尿症状机制。方法在初筛合格的SD大鼠颈背部皮下注射浓度为5%的D－gal生理盐水溶液125 mg/(kg·d)连续8周。观察动物在造模期间和停止造模后两周内24 h总尿量及水负荷后排尿情况的变化;通过测定模型动物尿中K+、Na+、CL－浓度，血中ALD、ADH、ANP浓度及肾脏病理形态学观察，探讨模型动物24 h总尿量增加的机制。结果与正常对照组相比较，模型组动物24 h总尿量明显增加;水负荷后6 h内排尿潜伏期明显缩短，排尿次数明显增多，但总尿量没有明显差异;模型动物尿中Na+、CL－浓度明显升高，K+浓度明显降低;血浆ALD、ADH含量显著降低，ANP含量显著增加，肾脏出现一系列硬化特征。结论D－gal致亚急性衰老大鼠出现的总尿量增加和排尿次数增多的情况可能与其ADH、ALD、ANP合成与分泌异常及肾脏病理形态学改变有关。

D－gal致亚急性衰老大鼠;多尿;机制

D－半乳糖(D－gal)致亚急性衰老动物模型是目前研究较为成熟，运用较为广泛的衰老动物模型，其在外观形态，神经内分泌系统、各主要脏器生理功能及病理形态改变等方面均与自然衰老动物具有较高的相似度。该动物的制备相对简单易行，模型较为稳定可靠，被广泛用于延缓衰老和防治老年痴呆药物的筛选和作用机制探讨。本研究对该种动物模型的尿液排泄情况进行初步观察，并通过测定与尿液生成密切相关的部分神经内分泌系统指标，初步探讨其多尿机制，旨在为该模型的进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2月龄SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体质量160～180 g，来源于广东省医学实验动物中心［SCXK (粤)2003－0002］。动物于室内温度(20±2)℃，湿度(50±5)%的环境中饲养，每笼5只，采用12 h∶12 h昼夜间断照明，每天定量添加饲料1次，换水2次，更换垫料2次，动物自由进食、饮水，SPF级饲料由广东省医学实验动物中心提供。

1.2 实验试剂

D－galactose，成都Mechem公司产品，由广州威佳有限公司分装，批号070918;Goat anti－rat arginine vasopressin enzyme immunoassay kit，catalogue No: QR301330103031 EIAUTL;Goat anti－rat atrial natriuretic polypeptide enzyme immunoassay kit，catalogue No:QRCT－3013321020009 EIAUTL; Goat－anti rat aldosterone enzyme immunoassay kit，以上试剂盒均为美国Ad litteram Diagnostic Laboratories，Ins产品。

1.3 实验方法

1.3.1 动物筛选:根据改良的Aston［1，2］法结合预实验结果制定动物初筛标准。取大鼠80只，雌雄各半，适应代谢笼1 d，于次日禁食不禁水18 h后，灌胃给予生理盐水作为水负荷2次，第1次3 m L/100 g，收集30 min尿液，第2次2 m L/100 g加30 min的尿量作为水负荷，收集2 h的尿量，淘汰排泄率低于25%和高于50%的动物(排泄率=尿量/给水量)。

1.3.2 动物分组:将初筛合格的动物分为正常对照组和模型对照组，雌雄各半，适应性饲养3 d后开始实验。模型组大鼠在消毒后的颈背部皮肤，用无菌注射器注射浓度为5%的D－gal生理盐水溶液125 mg/(kg·d);正常对照组注射等体积生理盐水，连续8周，停止注射后继续观察两周。造模期间每周称重一次，并根据动物体重调整D－gal的注射量［3－5］。

1.4 实验指标测定方法

1.4.1 排尿情况的观察［6，7］:①24 h总尿量:从造模开始，每周测定动物24 h总尿量一次。具体方法:动物禁食不禁水18 h，次日将动物置于代谢笼中，禁食，自由饮水，收集24 h尿液(放入和拿出前轻压大鼠下腹部排尽余尿，每4 h收集尿液1次避免挥发)。②水负荷后6 h内排尿情况:从造模开始，每两周测定动物水负荷后6 h内的排尿情况1次。具体方法:据大鼠体重灌胃给予生理盐水1 m L/100 g，立即收集30 min尿液，再次给予各组生理盐水4 m L/100 g加上30 min的尿量(用生理盐水代替)。将动物置于自制的特殊鼠笼中，观察并记录动物排尿潜伏期，6h内排尿次数及总量。

1.4.2 尿中Na+、K+、CL－浓度:将24 h总尿量测定实验中收集的尿液取2 m L分装于试管中，用全自动尿液分析仪测定Na+、K+、CL－浓度。

1.4.3 血浆ALD、ADH、ANP含量:于实验结束当天，大鼠眼眶后静脉丛取血1.5 m L，分别用肝素及EDTA－Na2、抑肽酶抗凝，室温下3500 r/min，离心15 m in，吸取上层血浆，用ELISA法测定血浆中ALD、ADH、ANP浓度，具体操作步骤按照试剂盒说明书要求。

2 实验结果

2.1 24 h总尿量的变化

与正常对照组相比较，模型组动物24 h总尿量自造模后第4周至第10周明显增加，两者差异有显著性(P＜0.05，P＜0.01)。结果见图1。

(注:与正常对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05)图1 24 h总尿量动态变化Note:Compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01Fig.1 The total volume of urine during 24 h at different times

2.2 水负荷后6 h排尿的变化

与正常对照组相比较，造模4周后，模型组动物水负荷后6 h内的排尿潜伏期明显缩短，排尿次数明显增加，两者差异有显著性(P＜0.05，P＜0.01);但水负荷后6 h内的总尿量，两组相比较没有显著性差异(P＞0.05)。结果见图2、3。

(注:与正常对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05)图2水负荷后6 h内排尿潜伏期的变化(Note:Compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01)Fig.2 The incubation period of urination within 6 h after water load

(注:与正常对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05)图3水负荷后6 h内排尿次数的变化(Note:Compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01)Fig.3 The frequency of urination within 6 h after water load

2.3 尿液中Na+、K+、CL-浓度的变化

与正常对照组相比较，模型组大鼠尿液中K+浓度明显降低，Na+、CL－浓度明显升高，两者差异有显著性(P＜0.05)。结果见表1。

表1 尿中Na+、K+、CL－浓度(±s，mmol/L，n= 10)Tab.1 Na+，K+，Cl－level in the normal and model rats

表1 尿中Na+、K+、CL－浓度(±s，mmol/L，n= 10)Tab.1 Na+，K+，Cl－level in the normal and model rats

注:与正常对照组比较，*P＜0.05。Note:Compared with the control group，*P＜0.05.

组别(Group)K+Na+CL－正常组(Control)110.32±30.98 30.54±7.56 40.22±9.54模型组(Model)77.54±10.77*70.22±18.02*90.43±16.77*

2.4 血浆ALD、ADH、ANP浓度的变化

从表2可以看出:与正常对照组相比较，模型组大鼠血浆ANP含量明显升高，ALD、ADH含量明显降低，两者差异均具有非常显著性意义(P＜0.01)。结果见表2。

表2 血浆ALD、ADH、ANP浓度(±s，pg/m L，n= 10)Tab.2 ALD，ADH，ANP levels in the normal and model rats

表2 血浆ALD、ADH、ANP浓度(±s，pg/m L，n= 10)Tab.2 ALD，ADH，ANP levels in the normal and model rats

注:与正常对照组比较，**P＜0.01。Note:Compared with the control group，**P＜0.01.

组别(Group)ALD ADH ANP正常组(Control)112.11±20.11 10.34±2.13 123.11±22.11模型组(Model)76.06±10.3**6.42±1.06**227.35±30.54**

2.5 肾脏组织病理学观察

2.5.1 HE染色:与正常对照组比较，模型组大鼠肾单位的数量明显减少，部分肾单位代偿性肥大，肾间质内结缔组织增生不明显;肾小球数目减少，球内毛细血管内皮细胞及肾小球囊壁层上皮细胞重度增生，系膜容积增大;肾小管萎缩，肾小管和集合管内皮细胞大量增生，部分肥大肾小管细胞融合，肾小管上皮细胞肿胀，管腔缩小，甚至已无小管管腔结构，部分近曲小管发生玻璃样变性。

2.5.2 PAS染色:与正常对照组比较，模型组大鼠肾小球囊壁层内皮细胞明显增生，系膜增生，毛细管袢受压，入球血管萎缩、硬化，基底膜增厚;肾小管萎缩，上皮细胞脂肪变性，管腔扩张，小管内皮细胞增生，基膜增厚。结果见图4(彩插3)。

3 讨论

D－gal致亚急性衰老动物模型是由我国学者首先提出的，经过世界范围内的长期研究和探索，该模型及其衰老学说得到了不断深入和发展，但该类模型在尿液生成与排泄方面的报道少见。基于此，本课题对该种动物模型的尿液排泄情况进行了观察，初步得出了D－gal致亚急性衰老动物模型会出现“多尿”症状，包括尿量增多(多尿)和排尿次数增加(尿频)。关于该种动物模型总尿量增多的机制，本课题由以下两方面进行初步探讨:

3.1 与尿液生成密切相关的神经内分泌系统

目前许多学者认为抗利尿激素、心钠素、醛固酮三者共同作用，是参与维持机体内环境最重要的因素，而这些激素的分泌与神经内分泌系统密切相关。

抗利尿激素(ADH)的主要作用是提高远曲小管和集合管对水的通透性，增加髓袢升支粗段对NaCL的主动重吸收和内髓部集合管对尿素的通透性，使髓质组织间液溶质增加，渗透浓度提高，利于尿浓缩，是尿液浓缩和稀释的关键性调节激素［6，7］。醛固酮(ALD)有潴钠排钾作用，可促进肾脏远曲小管及集合管重吸收钠、水和排钾，在调节水、电解质代谢方面扮演着重要的角色［8］。心钠素(ANP)具有强大的利钠、利尿作用，并具有快、短、强的特点，其作用从以下几个方面发挥:①心钠素可通过增加肾小球滤过率、增加肾髓质的血流量及抑制近曲小管和集合管对钠的重吸收，产生利尿利钠作用;②心钠素能抑制肾近球旁细胞释放肾素，并通过对肾素－血管紧张系统的抑制以及对肾上腺皮质的直接作用，抑制醛固酮的分泌，它不仅抑制醛固酮的基础分泌率，亦能抑制由ACTH、血管紧张素、钾等刺激的醛固酮分泌;③心钠素亦能抑制抗利尿激素的合成、释放及作用。据此，测定ADH、ALD、ANP对于分析亚急性衰老动物所出现的多尿症状具有重要意义。

实验结果显示，①D－gal致亚急性衰老动物血浆ADH含量明显降低，ADH分泌减少使肾小管对水液的重吸收功能下降，尿液浓缩过程障碍，导致尿液排泄增加。②模型动物24 h尿液中Na+、CL－排出量增加，K+排出量减少，这与参与肾脏水液代谢调节的重要潴钠激素ALD保Na+排K+的作用恰恰相反，初步考虑该种动物模型ALD的合成与释放受阻，使水的重吸收减少，尿量也随之增加。经测定亚急性衰老动物血浆ALD含量降低，提示该种模型ALD合成与分泌障碍可能是其24 h总尿量增加的原因之一。③衰老动物血浆ANP含量明显增加，说明该种动物肾小球滤过率、肾髓质的血流量增加，近曲小管和集合管对钠的重吸收减少，使得尿液的排出量增加。同时，ANP的增加可以抑制了ADH、ALD的分泌和释放，阻碍尿液的浓缩过程，从而进一步促使模型动物尿量增多。另外，ALD、ADH的分泌受到下丘脑－垂体－肾上腺皮质(HPA)轴的调控，我们在实验中观察到模型动物下丘脑、垂体、肾上腺萎缩，这可能是造成模型动物上述激素分泌异常的原因之一，即模型动物身体机体全面衰退，神经内分泌系统功能老化是其多尿的机制之一。

3.2 动物肾脏形态、功能的改变

尿的生成包括肾小球的滤过、肾小管和集合管的重吸收和分泌三个基本过程。肾脏是出现衰老比较明显的脏器之一，衰老肾脏的主要病理改变是肾小球硬化及小管间质纤维化，这些改变使得肾脏的生理功能受到很大影响，也是老年出现多种泌尿系统疾病的原因之一［9］。因此，在研究D－gal致亚急性衰老动物“多尿”机制的过程中，肾脏形态和功能的研究是一个重要的方面。有文献报道D－gal对肾脏的损害作用，主要通过产生大量的晚期糖基化终末产物(AGEs)和氧化应激损伤［8］。过多的AGEs在肾小球系膜和毛细血管部位沉积，使肾小球体积增大，肾小球系膜膨大，基底膜增厚，肾小球硬化［8］，这与本研究的结果基本一致。由于肾脏与尿液生成、排泄的关系较为复杂，该模型动物肾脏形态学改变与其“多尿”的关系还有待进一步探讨。

(本文图4见彩插3。)

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［3］Song X，Bao M，Li D，et al.Advanced glycation in D－galactose induced mouse aging model［J］.Mech Aging Dev，1999，108 (3):239.

［4］Zhang Q，Huang YG，Li XK，et al.GM1 ganglioside prevented the decline of hippocampal neurogenesis associated with D－galactose［J］.Neuropharmacol Neurotoxicol，2005，16(12): 1297.

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Polyuria and Its M echanism in D-Galactose-Induced Aging Rats

TAN Ying1，HUANG Ping2，CAO Hong－yin2，CHEN Qiu－ling2，WU Qing－he2
(1.Yunnan Institute of Materia Medica，Kunming 650111，China;
2.Traditional Chinese Medicine University of Guangzhou，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo observe the changes of urination of D－galactose－induced aging rat models and explore its mechanism.M ethods The senescent mouse model was established by subcutaneous injection of D－gal(5%，125 mg/kg·d) for 8 weeks.To measure the total volume of urine during 24 h and the frequency of urination within 6 h after water load during the injection period and convalescent period and detect the contents of ALD，ADH，ANP in blood and K+，Na+，CL－in urine，and examine the renal pathomorphology.Results Compared with the control group，the total volume of urine during 24 h was increased，incubation period shortened and the frequency of urination increased within 6 h after water load(P＜0.05，P＜0.01).The concentration of Na+，CL－，ANP was increased and the ADH，ALD，K+decreased(P＜0.05，P＜0.01).At the same time，some renal histological changes were observed in the aging models.ConlusionThe D－galactoseinduced aging rat models have characteristics of polyuria.The mechanism of their polyuria is related with decreased ADH and ALD synthesis and secretion，increased ANP increase，and sclerotic alterations of the kidneys.

D－gal mimetic aging rats;Urination;Polyuria;Mechanism

R－33

A

1005－4847(2010)04－0296－04

2009－12－21

国家自然科学基金(编号:30873425)。

谭莹(1979－)，女，博士，云南省药物研究所药物安全性评价中心。

吴清和，男，教授，博士生导师，E－mail:zyylb@gzhtcm.edu.cn