以唑草·苯磺隆为模型研究酮类小分子与牛血清白蛋白的相互作用

王 珊，高丰琴，杨小玲

(咸阳师范学院 化学与化工学院，陕西 咸阳 712000)

蛋白质是组成生命的主要物质之一，各种生命活动与蛋白质都分不开。迄今为止在生命科学，化学等众多领域的研究中，蛋白质的研究一直都占有举足轻重的地位，特别是对小分子与蛋白质的探究[1-2]。

关于蛋白质构象的研究最主要的是荧光光谱法，从不同的角度来研究分子结构和键与键之间的结合效果，以此反映蛋白质的功能。近几年唑草酮杀草范围广、效果明显、对后茬作物没太大的影响，因此在麦田里得到广泛应用[3-6]。这种方法之所以被应用于研究唑草酮与牛血清白蛋白之间的相互作用是由于其有很多优点，比如灵敏度高，运用起来较方便以及用量比较少等。

对于药物中小分子与蛋白质相互作用的反应过程中响应信号的变化，通过具体的分析，确定该响应信号和系统参数之间的数学关系，或通过查找探针和合适的蛋白质体系结构，改变现有的反应模型的缺点，进一步得到蛋白质的结构,建立一个更清晰的图像反应，为识别、筛选和解毒剂的研制提供强有力的依据。研究农药与血清白蛋白之间的结合作用，有利于深入了解农药对人、畜的中毒机制，对指导科学有效的使用农药具有重要意义[7-8]。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

牛血清白蛋白：分析纯，百灵威试剂公司；草甘膦铵盐：质量分数30%，分析纯，镇江江南化工有限公司；唑草·苯磺隆：分析纯，浙江新安化工集团股份有限公司； 三羟甲基氨基甲烷：分析纯，天津化学试剂厂。

SPECORD 50型紫外可见吸收光谱仪：德国耶拿公司；RF-5301型荧光分光光度计：日本岛津公司。

1.2 实验步骤

1.2.1 配制缓冲溶液

(1) 先称3.634 2 g三羟甲基氨基甲烷(C4H11NO3)，以少量蒸馏水溶解，配成0.1 mol/L的Tris溶液；

(2) 取1 mol/L盐酸加水配成0.1 mol/L的盐酸溶液；

(3) 取250 mL 0.1 mol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液于烧杯中，再加入210 mL 0.1 mol/L的盐酸溶液，用盐酸和氢氧化钠调节混合溶液pH至7.40，最后用蒸馏水加至刻度处，于阴凉干燥处保存备用；

(4) 在天平上称量氯化钠固体1.2 g，然后加入41 mL蒸馏水，搅拌使氯化钠固体溶解，配制成浓度为0.5 mol/L的氯化钠溶液；

(5) 量取250 mL 0.1 mol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液于烧杯中，再加入210 mL 0.1 mol/L的盐酸溶液，用盐酸和氢氧化钠调节混合溶液pH至7.40，最后用蒸馏水加至刻度处。

1.2.2 配制唑草·苯磺隆溶液

在分析天平上称量0.143 7 g唑草·苯磺隆固体，加入200 mL蒸馏水，在水浴锅中加热溶解配制成2×10-3mol/L的溶液。

1.2.3 配制牛血清白蛋白

在分析天平上，准确称取0.065 g牛血清白蛋白晶体，用配好的浓度为2.0×10-6mol/L 的Tris-HCl缓冲溶液配成备用液。

1.2.4 不同浓度溶液的配制

(1) 取8个容量相同的比色管，先分别依次加入2 mL BSA、2 mL NaCl、2 mL Tris-HCl缓冲溶液；

(2)依次加入唑草·苯磺隆除草剂的浓度分别为0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6、28×10-6mol/L，最后用蒸馏水定容到刻度线处，来回摇晃使其混合均匀，在一定温度下固定放置一段时间。

1.3 不同浓度唑草·苯磺隆与牛血清白蛋白荧光光谱的测定

(1) 将浓度不同且已经配好的溶液依次倒入石英比色皿中，荧光发射与激发狭缝宽度是5∶5，固定波长在280 nm处，依次测定300～450 nm间光谱，每次记录最大荧光强度和对应波常数；

(2) 在相等温度下扫描混合溶液的同步荧光光谱等。

2 结果与讨论

2.1 唑草·苯磺隆与牛血清白蛋白的相互作用

不同浓度的唑草·苯磺隆溶液中BSA的荧光发射光谱见图1。从图1可以知道，BSA最大的吸收峰在347 nm处，BSA的荧光强度随着唑草·苯磺隆浓度的增大，而显示有规律降低的趋势，但BSA的峰形没有发生大的变化。表明唑草·苯磺隆与BSA之间发生了相互作用，使荧光物质发生猝灭。

λ/nm1-BSA；2-BSA+ c(药物)=4×10-6mol/L；3-BSA+ c(药物)=8×10-6 mol/L；4-BSA+ c(药物)=12×10-6 mol/L；5-BSA+ c(药物)=16×10-6 mol/L；6-BSA+ c(药物)=20×10-6 mol/L；7-BSA+ c(药物)=24×10-6 mol/L；8-c(药物)=28×10-6 mol/L，c(BSA)=2×10-6 mol/L图1 不同浓度唑草·苯磺隆与BSA的发射荧光光谱

当某些小分子与蛋白质结合，其荧光强度有所下降，这种现象称为荧光猝灭作用[7-8]。基态分子和猝灭剂之间的结合是动态猝灭，它依照Stern-Volmer方程[9]：

F0/F=1+Kqτ0c=1+Ksvc

(1)

式中，c为猝灭剂浓度；τ0为荧光分子的平均寿命，不含有猝灭剂时其数值是10-8s；F0为没有猝灭剂时荧光物质的荧光强度；F为含有猝灭剂时的荧光强度；Kq为动态荧光猝灭速率常数，L/mol·s，是大分子的荧光寿命和分子扩散的衰减速度与相互碰撞的反应。

已知生物大分子荧光寿命约为10-8s，各类猝灭剂对生物大分子最大动态荧光猝灭速率常数为2.0×1010L/mol·s[10]；由(1)式能够得到BSA和唑草·苯磺隆反应的Stern-Volmer曲线见图2，其中c(药物)=4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6、28×10-6mol/L。

c(药物)×10-6/(mol·L-1)图2 唑草·苯磺隆与BSA的Stern-Volmer曲线

由直线斜率可求得Ksv=1.5×104L/ mol，进一步求得Kq=1.5×1012L/mol·s，因此可知，动态猝灭的假设不成立，故酮类小分子对BSA的荧光猝灭是静态猝灭[11]。

静态荧光猝灭作用见图3，根据Lineweaver-Burk双倒数方程[12]，即：

(2)

可得出静态猝灭结合常数KLB=1.5×104mol/L。

c-1×106/(L·mol-1)图3 BSA和唑草·苯磺隆的双倒数曲线

2.2 唑草·苯磺隆与牛血清白蛋白的同步荧光光谱

唑草·苯磺隆与牛血清白蛋白的同步荧光光谱见图4。

λ/nm1-BSA；2-BSA+ c(药物)=4×10-6 mol/L；3-BSA+ c(药物)=8×10-6mol/L；4-BSA+ c(药物)=12×10-6 mol/L；5-BSA+ c(药物)=16×10-6 mol/L；6-BSA+ c(药物)=20×10-6 mol/L；7-BSA+ c(药物)=24×10-6mol/L；8-c(药物)=28×10-6 mol/L，c(BSA)=2×10-6 mol/L图4 不同浓度唑草·苯磺隆与BSA的同步荧光光谱

由图4可见，明显具有蛋白质的光谱特征。随着唑草·苯磺隆浓度增大，荧光光谱强度逐渐降低。这说明唑草·苯磺隆与牛血清白蛋白可能形成了新的化合物，而因此发生了猝灭作用。目前酮类小分子与牛血清白蛋白的相互作用已有较多研究[13-15]。

荧光分子与猝灭剂之间的结合常数见图5，其中c(药物)=4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6、28×10-6mol/L。

关系式为：

lg[(F0-F)/F]=lgK0+nlgc

(3)

其中，F0、F和c的意义与式(3)相同；K0为荧光猝灭反应的平衡常数；n为结合点位数。以lg[(F0-F)/F]对lgc作双对数图，其线性方程的斜率和截距分别为为结合点位数n=1和lgK0=4.98。

lgc×10-6图5 BSA和唑草·苯磺隆的的双对数曲线

2.3 唑草·苯磺隆与牛血清白蛋白的紫外光谱

不同浓度的唑草·苯磺隆与牛血清白蛋白的紫外光谱图见图6。由图6可知，随着药物浓度的增加，紫外峰的强度逐渐降低。

λ/nm1-BSA；2-BSA+ c(药物)=4×10-6 mol/L；3-BSA+ c(药物)=8×10-6mol/L；4-BSA+ c(药物)=12×10-6 mol/L；5-BSA+ c(药物)=16×10-6 mol/L；6-BSA+ c(药物)=20×10-6 mol/L；7-BSA+ c(药物)=24×10-6mol/L；8-c(药物)=28×10-6 mol/L，c(BSA)=2×10-6 mol/L图6 BSA和唑草·苯磺隆的紫外可见吸收光谱

纯BSA和纯唑草·苯磺隆的紫外可见光谱图的对比见图7。由图7可知纯BSA没有猝灭作用，说明猝灭作用是由于唑草·苯磺隆与BSA结合引起的。

λ/nm1-c(药物)=2×10-3 mol/L；2-c(BSA)=2×10-6 mol/L图7 纯BSA和纯唑草·苯磺隆的紫外可见吸收光谱

3 结 论

通过模拟动物体的生理条件，研究唑草·苯磺隆与牛血清白蛋白之间存在的相互作用。由实验结果分析可知，BSA与唑草·苯磺隆之间的猝灭方式是静态猝灭，得出其静态猝灭结合常数是KLB=1.5×104L/(mol·s)，其结合点位数n=1。可以为研究唑草·苯磺隆除草剂的药理、毒理提供依据，为进一步研制解药提供基础。

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