微纳气泡的三维动态表征

刘 俊，梁 霄，王淦诚，何炳恩，龚湘君

(华南理工大学材料科学与工程学院，广东广州 510640)

根据国际标准化组织(International Standardization Organization，ISO)定义，直径<100 μm的气泡称为微纳气泡[1]。微纳气泡可附着于表面或存在于溶液中。研究表明，微纳气泡是热力学不稳定体系[2-3]，一般倾向于上浮至水面破裂或溶解于水中。研究表明，直径在1 mm以上的大气泡会快速上浮并破裂，而微纳气泡的上浮则相对缓慢，且随着尺寸的继续减小，这种上浮趋势甚至会消失。譬如，水中直径为10 μm的气泡会以1 mm/s的速度上升[4]，有时伴随着在水中的溶解消失，而纳米气泡在水中做布朗运动，几乎不会上浮，其在水中甚至可稳定长达数天[5]，这不能用经典的拉普拉斯方程解释[6-7]。气泡破裂时会在其周身产生显著的水动力，破裂能随气泡尺寸的减小而增大。微米尺度的气泡在水中极少发生聚集[8]，但是，一旦受到外部能量(如超声波)的干扰，汇聚现象就会发生，并释放可观的能量，足以杀死细菌[9-10]。一般而言，微纳气泡在pH值为2～12的溶液中带负电荷，这是水分子中OH-吸附在气泡界面的结果。但是，通过添加电解质[11]或表面活性剂[12]，微纳气泡的表面电势可以由负转正。目前，研究者利用原子力显微镜发现，固体表面的纳米气泡具有超大的接触角，可降低附加压力并延长其寿命[13]。然而，溶液中微纳气泡的产生及稳定机理仍然不清楚。 因此，尽管微纳气泡已被广泛应用于矿物浮选[14]、污水处理[15]、采油[16]、土壤改良[17]等领域，但溶液中微纳气泡的基础研究并不成熟，主要原因是缺乏合适的表征方法。表征微纳气泡，尤其是溶液中微纳气泡的难点有：(1)微纳气泡特别是纳米气泡，由于本身尺度小且极易受到扰动，很难被观测；(2)难以区分尺度相近的杂质颗粒和微纳气泡；(3)微纳气泡的局部可能具有高浓度，并可发生诸如聚集、破裂等复杂、快速的动态变化。

1 微纳气泡的表征方法

相对于其他的微粒，微纳气泡具有易受扰动、形态多变、粒径分布宽、折射率比水小等物理特性。当前存在多种微纳气泡的表征方法(表1)，根据微纳气泡的物理特性，有测量微纳气泡粒径及其分布的原子力显微镜法[18]、激光动态光散射法[19]、多波长消光法[20]、二维图像法[21]，其中，原子力显微镜法、二维图像法和衍射法[22]还可以得到样品的形貌，多波长消光法可以获知样品密度；有检测高浓度微纳气泡样品密度和成分的低场核磁法[23-24]。

原子力显微镜法利用由连接精密压电陶瓷的精细探针探测pN～nN级别的原子力，并利用激光将原子力与探针的空间位置一一对应，可获得纳米尺度的三维形貌和精细的相互作用，并可得到测量对象的软硬度。但是，该方法适合观察表面附着的气泡，不能获得实时动态的数据，无法观察溶液中的气泡[18]。

激光光散射方法主要用于获知气泡的尺寸分布[19]，可分为动态光散射光强相关法、衍射法等。光强相关法的大致原理：当激光照射到远小于其波长或接近其波长的小颗粒上，光会发生瑞利散射或米氏散射。由于小颗粒的布朗运动，散射光的强度随时间波动并与颗粒在溶液中的扩散有关，通过测量散射光强的时间相关性获知颗粒的扩散特性，并对应至颗粒的流体力学尺寸[25]。衍射法收集散射颗粒不同角度的散射光，得到其空间分布。根据米氏散射原理，从散射光强的空间分布中获知其尺寸信息[22]。

二维图像法[21]，根据观测对象的尺寸搭建具有一定放大倍数的可见光成像光路，对获得的微气泡图像进行二值化、轮廓识别和计数统计，得到气泡的粒径分布。但是，所获得的仅为二维信息，摄像机的景深导致图像实际为沿光轴方向一定距离的气泡在物平面的投影，从而导致各种计算偏差，在高浓度下由于三维轨迹的二维投影重叠，难以获得实际轨迹，受限于衍射极限，该方法只能观测微米尺寸的颗粒，且不能分辨颗粒的材质。二维追踪法是二维图像法的另外一种应用，利用类似暗场照明的方法将溶液局部照亮，不断拍照累积光路中散射颗粒的运行轨迹，利用图像分析对这些轨迹进行二维追踪，并计算均方末端距用于关联颗粒的流体力学尺寸。

以上方法可准确测量微纳气泡的尺寸及分布，但均需要积累一段观测时间来获取有统计意义的数据；同时，除去尺寸信息(衍射法基于静态光散射，可获知规则物体的形状信息，譬如杆状、球状等)，很难得到气泡局部的形貌特征和局域变化，亦无法分辨气泡和其他杂质。这些方法在高浓度应用时亦存在问题。

此外，还有一些独特的表征方法，譬如多波长消光法，计算颗粒的消光系数并结合Lambert-Beer定律，对消光谱进行反演，得到具有统计意义的气泡粒径分布[20]，该方法光路简单，可进行原位在线的测量；又如低场核磁法，利用氢原子的能级跃迁，可非接触地获得含氢流体的水分子迁移率等信息，可获得高浓度下的纳米气泡浓度[23]，并可粗略判断气体化学组成[24]。但是，这些方法仍然无法获知局部的动态和物性信息。

综上，常见的气泡表征方法均有各自的优势，但仍存在多种共同的局限，即无法准确、精细、全面地观察局部变化和动态过程，难以获知微纳气泡的形貌，以及不能区分与气泡同等尺寸的杂质。因此，发展了一种针对微纳气泡的三维动态成像技术——数字全息显微术(digital holographic microscopy，DHM)[28-29]。它利用光的干涉，记录多个微纳尺度颗粒的实时全息图像，并对其进行三维重建，获取其运动轨迹、形态及相位，具有通量高、景深大、高精度、无损、包含材质信息等优点。该技术既可以观测表面微纳气泡，亦可观测体相微纳气泡。以下部分将详细阐述如何利用DHM观察微纳气泡，获得多个气泡的三维轨迹和相图，并基于相图中折射率的差异区分气泡与其他固体微粒。

表1 气泡的常见表征方法Tab.1 Common Characterization Methods for Bubbles

图1 DHM光路图 (a)共轴模式；(b)离轴模式Fig.1 Schematic of DHM (a) In-Line DHM; (b) Off-Axis DHM

2 数字全息显微镜

2.1 数字全息显微镜的原理

DHM源于传统光学全息术[30]，以数字形式，对全息图像(即物体散射光场和已知相位的参考光场发生干涉，从而形成明暗相间的干涉条纹)进行记录和处理，克服了传统方法光学重建较为繁琐且需用到化学记录介质的问题[31]。自主搭建了基于共轴和离轴光路的两套DHM(图1)，分别以LED(λ=455/505 nm)和半导体激光(λ=473 nm)作为照明光源产生平面波。全息图经过显微物镜放大后，由sCMOS相机进行快速拍摄和记录。结合高倍物镜，数字全息显微镜的成像极限可以达到50 nm以下(金属颗粒)，用于细菌和颗粒追踪时，它的轴向定位精度均在单颗粒以下[28-29]。其中，对于200 nm的Latex颗粒，其轴向定位精度在58 nm[28]。

记录的全息图用算法进行物体波前信息的重建，主要包括3个步骤：背景扣除、光场重建和局部寻峰。背景扣除是对一组连续拍摄的原始全息图像[图2(a)]进行平均处理，生成背景全息图，然后对每一张原始全息图进行背景图的扣减[图2(b)]，这样可以去除表面杂质和光路缺陷所引入的干扰信号。光场重建使用的是瑞利-索末菲(Rayleigh-Sommerfeld，RS)反向传播法[32](共轴DHM)及角谱法(离轴DHM)[33]。RS反向传播法基于衍射的球面波理论，即重建像平面内任一点的复光场E(x,y)，等于全息图平面∑0内每一个点(x0,y0)发出的球面波在传播水平距离z后在点(x,y)处的叠加。

图2 (a) 微纳气泡的全息图；(b) 扣减背景后的全息图；(c) 重建过程Fig.2 (a) Hologram of Microbubbles; (b) Hologram with Background Subtracted; (c) 3D Reconstruction

(1)

式(1)写成卷积形式为式(2)。

E(x,y)=E0(x0,y0)⊗h(x,y)

(2)

由卷积定理，式(2)可以进一步表示成式(3)～式(5)。

E(x,y)=F-1{F{E0(x0,y0)}·F{h(x,y)}}

(3)

k=kx2+ky2+kz2

(4)

(5)

其中：E(x,y)——光场分布；

k——波数，m-1；

l——光传播距离，m；

h(x,y)——Rayleigh-Sommerfeld 传播函数；

F-1和F——傅里叶逆变换和傅里叶变换。

重建的三维光场由竖直方向上的一叠一定间隔的二维图层组成[图2(c)]，并从式(3)中求得光强的三维分布。为获得目标物的三维位置和形态，先设定一个阈值，过滤掉光场中和样品无关的低值噪音；然后，再用一个边长为w的正方体对重构空间进行分割和逐点搜寻，找到局部光强最大值点，并标记为样品颗粒的可能位置，w值的选取与样品本身尺寸和密度有关；之后，基于这些可能的位置，进一步利用空时一致性进行位置的连接，得到被追踪物体的实时三维轨迹。基于样品的轨迹，可以进一步提取物体在其三维位置上的聚焦面形态[图2(c)]，并分析近界面处微粒的密度分布、三维速度、运动取向，以及与表面的碰撞概率等动态信息[28,34]。为获得目标物的形态，根据样品的三维坐标，提取该位置的光场截面图像。

离轴全息(off-axis DHM)由于没有孪生相的干扰，可用于精确复原目标物体的位相。基于角谱法[式(6)]恢复离轴全息图的位相。角谱法的理论基础是衍射的平面波理论，衍射的平面波理论认为，重建面的光场分布是沿不同方向传播的多束平面光波矢量叠加的结果，遵循的赫姆霍兹方程可在频率域下准确描述光波的衍射过程。频率域和空间域的转换可以通过二维离散傅里叶变换和傅里叶逆变换来实现[33]。气泡的折射率比水小，而一般杂质的折射率比水大，因此，前者与背景介质的位相差为负值，后者则为正值，可用于作为区分气泡和其他杂质的标准[35]。

(6)

其中：A0——全息面的角谱。

对样品的复振幅分布E(x,y)求反正切，即可获得其相位分布φ(x,y)，即光程差，其对应目标颗粒物的形态分布，如式(7)。

(7)

其中：φ(x,y)——相位分布；

Im——函数虚部；

Re——函数实部。

离轴全息适用于表面微纳气泡的观测，它的横向和纵向分辨率分别为100 nm和10 nm。

2.2 数字全息显微镜的应用

基于景深大、通量高、无须标记等优点，数字全息显微镜(DHM)被广泛应用于粒子追踪和三维成像领域。不同于非生命颗粒，生物细胞通常会对环境变化产生主动响应，并随之改变运动行为，这些对常规检测手段来说不易捕捉的信息往往蕴涵着重要的价值，可以被DHM轻松记录和再现。使用DHM追踪生物实体最大的优势在于它自带标记属性，有利于保持样品颗粒最原始的生理状态。Heydt等[36]使用同轴全息研究了石莼游动孢子在3种不同化学修饰表面的着陆行为并对其运动模式进行了区分。经过定量化分析，发现孢子的运动模式和表面化学性质息息相关，同时认为附着孢子在表面的旋转运动是其探索和选择定植表面位点时所采取的感应策略。Maleschlijski等[37]利用全息获取了数百条不同化学表面上藤壶幼虫的运动轨迹，并将其归类为5种运动模式，包括螺旋运动(spiralling)、游动(swimming)、下沉(sinking)、旋转(rotating)、行走(walking)。这一工作有助于理解藤壶幼虫游动行为和表面选择的关联性，可助力研发和设计新的防污涂层。Sheng等[38]运用DHM探究了2种尺寸相当但游动特征和营养类型不同的鞭毛藻对猎物的响应行为。结果显示，混乱分布的2种鞭毛藻在引入猎物后都会发生簇拥现象，并表现出复杂多变的泳动行为。游速慢混养型的K.veneficum面对猎物时速度、螺旋半径和螺距会减小，但角速度会增大；而游速快异养型的P.piscicida采取的捕食策略是增大游速、螺旋半径和角速度，略减小螺距。Choi等[39]利用DHM技术测量了圆形微管中流动人体血红细胞的3D体积速度场。细胞的形态特征是其生理状态的反映，运用离轴全息可以重建细胞的三维轮廓，从而定量评估细胞形态参量与其生理状态的联系。Rappaz等[40]借助离轴DHM测量了单个红细胞的折光率，并定量计算了正常红细胞和乙醇固定红细胞整个表面的细胞膜波动幅度，分别为(35.9±8.9)nm和(4.7±0.5)nm。该方法为红细胞动力学提供了新的见解，有望进一步用于探究生理和药理效应物对红细胞的作用。Nygate等[41]运用离轴DHM和深度学习的方法实现对精子细胞的虚拟染色和形貌分析。该方法可以节省宝贵的样品处理时间，规避化学染料可能带来的毒副作用，同时对多种类型的细胞进行区分着色，在临床医疗研究中有着重要的应用价值。Wilson[42]以孤立鞭毛的P.berghei雄配子为研究模型，使用高速DHM首次揭示了此类微生物的三维鞭毛波形，推翻了鞭毛动力学与其分子结构(手性)存在关联的错误认知，得出了微生物的附属动力结构对鞭毛节拍有着不可忽视影响的推论。PHI[43]、IPRASENSE[44]、Ovizio[45]等公司先后开发了无透镜紧凑型的DHM系统，其体积小巧，可放置于培养环境下用于进行细胞的形态观测。Lyncee Tec[46]公司开发的离轴型DHM被用于观察光学元件缺陷和表面精细结构及应力变化。然而，截至目前，DHM尚无商业化的仪器应用于做颗粒和气泡的三维观测和追踪。

本课题组利用自主搭建的DHM，立足于解释微生物的动态黏附机理和优化DHM定位追踪算法，开展了一系列研究工作。首先，细菌在界面附近的三维运动和黏附是一个连续、统一的过程，对细菌黏附于不同性质表面之前的近界面三维运动行为进行追踪和还原可为细菌的界面黏附机制提供更多的线索和诠释角度。Qi等[28]观测了不同电荷性质和亲疏水性的聚合物表面上大肠杆菌的三维动态行为，发现疏水表面会降低细菌的游速，这是细菌鞭毛碰撞到表面即尾部碰撞的结果，且细菌与疏水表面发生尾部碰撞时持续时间更长，细菌自身的推进力是影响其黏附的重要因素。结合碰撞模型，定量估算细菌通过鞭毛与表面发生尾部碰撞，进而产生黏附的临界吸引力值，为0.008 nN/μm；对于具有不同降解速率的聚己内酯均聚物、共聚物形成的“动态表面”，认为细菌黏附的不同主要取决于两方面的因素：一是细菌与“动态表面”基底的黏附力更弱，二是细菌对小分子降解产物具有趋化排斥反应，倾向于逃离表面[34]。Peng等[47]指出，大肠杆菌和海洋菌铜绿对不同软硬度的聚二甲基硅氧烷表面具有主动响应性，细菌在较软的表面上出现更多的tumble(翻滚)和flick(轻敲)等特征运动，RNA转录组测序的结果也进一步验证了这一结论。Huang等[48]研究了微米尺度的表面形貌对人体精子运动行为的影响，结果表明，流体力学作用力是调控细菌运动的主要因素。粗糙度的增大不利于精子的迁移，具体表现为精子的轴向振荡增强，运动速度出现衰减，运动朝向角分布更宽，运动模式中的helical、hyperactivated 和hyperhelical 所占比例下降。有趣的是，当表面特征形貌与精子尾部尺度一致时，精子可以通过尾部的摆动来抵抗表面形貌对它的调控。

DHM虽适用于各种材质和形状的样品，但不同种类的样品，如纳米颗粒、细胞和细菌，由于运动特性的不同，对DHM三维定位精度的要求也各不相同。同时，高浓度下的粒子追踪一直以来是一大难题。因此，为了推广DHM的微观应用场景，进行了定位追踪算法的改进和优化。Huang等[29]将基于数值重建的高斯轴向拟合算法引入DHM中，提高了不同记录条件下算法的轴向定位精度。数据表明，算法定位精度受到物镜放大倍数、入射光强度和光照均匀度的影响，优化后的轴向定位精度对大肠杆菌和PLPs(0.2 μm)分别可以达到318 nm和58 nm；之后，又利用基于图像光强的轴向定位算法实现了近界面高精度定位。Wang等[49]开发了一种高浓度下基于成本函数和图像识别的连接轨迹片段的算法，用以研究细菌在游走过程中感应到邻近同伴后的运动行为变化。该算法在细菌浓度低于3×107mL-1时准确率高于96%，对样品形状无特殊要求，可进一步应用于颗粒、气泡等体系。

DHM尽管有着数十年的发展历史，目前用于科学研究居多，商业化的产品则较为少见。为了进一步发挥DHM的商业价值，在未来，它将朝着小尺寸、无透镜、大视野、可快速重建等研究方向发展。

3 微纳气泡的三维表征与结果讨论

Tian等[50]利用激光同轴全息可得到1 cm见方范围内大量微米气泡的尺寸和三维分布。Shao等[51]提出了一种混合气泡全息图处理方法，用于在1 cm见方的大范围内测量微米、亚毫米和毫米气泡的尺寸和三维分布。Hall等[52]利用同轴全息观察了水面溅起的小液滴。然而，尚无一种方法将大量气泡的三维定位与追踪观察相结合，并同时得到气泡的尺寸、形态、三维位置和相图(材质)的信息。基于此，利用自建的DHM，观察了表面活性剂稳定的微纳气泡的三维动态行为。

微气泡由搅拌桨搅拌加入0.008%表面活性剂十二烷基苯磺酸钠的超纯水产生，表面活性剂用以降低气泡所受的附加压力，从而使气泡稳定[53]，包含微纳气泡的该液体经内径为0.6 mm的软细管由蠕动泵注入并导出至干净的玻璃观察皿。该观察皿使用食人鱼洗液(70%浓硫酸与30%过氧化氢溶液的混合液)进行预处理，增强表面的亲水性。在观察皿中制造厚度约2 mm的水层进行观察。利用被摄物散射单色光产生的干涉现象，得到包含被摄物三维位置信息的全息图，计算得扣减背景的全息图，由Rayleigh-Sommerfeld算法进行三维重建，并得到气泡的三维位置和尺寸大小，如图3(a)所示。

在获得了一段时间视场内多张全息图的基础上，通过局部寻峰算法，结合气泡运动的空时一致性，获得一定时间段内源源不断进入视场中的大量微气泡的三维位置和尺寸(图3)。图3(a)为一个瞬间视野体积内所有气泡的尺寸和位置分布。由图3(a)和图3(b)可知，80%以上的微纳气泡集中在6 μm以下，越小的气泡数量越多。对30 s内通过视场的部分气泡进行轨迹追踪，结果如图3(c)所示，可见气泡的流向一致，水流速度渐慢导致后进入视场的气泡速度下降。全体轨迹在z方向的平均上浮速度为7.56 μm/s，但由于人造水平流场，出现了部分气泡在z方向下沉的结果。

图3 (a)微纳气泡的三维分布；(b)尺寸分布；(c) 三维运动轨迹Fig.3 (a) 3D Distribution of Microbubbles with Distinct Sizes; (b) Size Distribution; (c) 3D Trajectories

进一步将气泡发生装置置于离轴DHM光路中，以获得水体中微气泡的相位信息。对获得的微气泡全息图[图4(a)]，使用角谱法进行图像的三维重建，得到水中气泡的相位差图[图4(b)]，相移恰是由于空气与水折射率不同产生的光程差。相对于水相为负的相移表明通过该物质使光程减小，故该物质的折射率小于水，与空气折射率小于水的实际情况一致[35]。

图4 (a)一个微纳气泡的离轴数字全息图；(b) 相差图；(c) 气泡存在导致相差为负的原理图Fig.4 (a) Hologram of a Microbubble by Off-Axis DHM; (b) Phase Difference Map;(c) Schematic for Negative Phase Deviation Caused by a Bubble

4 结论

针对现有微纳气泡表征手段存在的问题，发展了基于数字全息显微镜的无损、高通量的微纳气泡三维表征技术，获取了多个气泡的实时三维轨迹和相图，为进一步分析气泡的尺寸和密度分布、局部动态变化过程以及区分相近尺度的气泡和杂质颗粒奠定了基础。在未来，将进一步提升数字全息显微镜的定位和位相解析精度，并设计针对高浓度多重散射干扰的三维重建算法，同时基于机器学习等算法，提高计算重构的速度。该技术将有望从新的角度揭示微纳气泡在溶液中的动态行为和物理化学特性，从而更好地指导微纳气泡的实际应用。