基于COⅠ基因的储粮象甲害虫的分子检测技术研究

吴 芳，龚 殊，严晓平

(1.宜宾学院质量管理与检验检测学部，四川 宜宾 644000； 2.中储粮成都储藏研究院有限公司，四川 成都 610091)

鞘翅目象甲科储粮害虫包括阔鼻谷象、罗望子象、谷象、米象和玉米象[1]，其中谷象属的米象、玉米象和谷象是世界分布的储粮大害虫[1-2]，尤其是玉米象为头号储粮大害虫[1]。米象和玉米象由于形态和生态分布都非常接近，仅仅从形态上对它们进行鉴别非常困难。探索新的方法弥补形态鉴定的不足显得尤为重要[3]。随着分子生物学技术在昆虫分类中的广泛应用，为储粮害虫的快速准确鉴定提供了新的方法。线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mtDNACOⅠ)基因是目前测序最多，结构和动力学研究最为清楚的基因之一，其结构相对保守，种间变异较多，能够提供丰富的系统发育信息，自Hebert等[3]首次提出利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因作为DNA条形码以来，该技术已在鳞翅目[4-6]、鞘翅目[7-8]、半翅目[9]、等翅目[10]和弹尾目[11]昆虫的分类鉴定中得到广泛应用。近年，该技术开始在储粮害虫书虱[12-13]、扁甲类[14-15]、象甲类[16]的鉴定方面得到应用。本研究以3种常见象甲类储粮害虫为研究对象，对其COⅠ基因片段进行研究，以期实现DNA条形码技术对储粮象甲种类的快速鉴定，弥补形态鉴别存在的不足。

1 材料与方法

1.1 研究材料

供试材料为采自中国、印度、泰国、澳大利亚和德国5个国家的米象、玉米象和谷象，共38个样本，以采自四川峨眉的苜蓿叶象作为参照扩增，标本原始采集地见表1。所有样本都经形态学鉴定，保存于中国储粮害虫防治应用技术研究中心-20℃低温冰箱中。另外，在GenBank上检索了储粮象甲类的所有COⅠ基因序列用于比对分析(截止2017-02-28)，包括米象COⅠ基因序列8条，玉米象87条，谷象3条，罗望子象1条，阔鼻谷象1条。选取储粮害虫赤拟谷盗为外群[17]。

1.2 基因组DNA提取

采用试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取供试储粮象甲的总DNA，具体提取方法依照试剂盒使用说明书。

1.3 COⅠ基因扩增

选用Folmer等[18]的通用引物，由上海派森诺生物科技股份有限公司合成，上游引物LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)，下游引物HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)，产物大小约700 bp。

PCR扩增采用50 μl反应体系；象甲DNA模板5 μl，10×Buffer 5 μl，dNTPs 2 μl，10×Taq酶1 μl，引物各10 μl，引物浓度为10 μmol/L。扩增条件：95℃预变性5 min；然后按以下反应条件进行35个循环：95℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s；最后72℃延伸7 min。

1.4 PCR产物检测与测序

供试样品及原始采集地见表1。

表1 供试样品及原始采集地

产物检测：取5 μl PCR扩增产物，在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电泳条件120 V，约30 min。电泳结束后溴化乙锭(EB)染色10 min，用凝胶成像系统Gel-Doc Universal Hood II分析电泳结果，检测合格的PCR扩增产物用于后续分析。

产物的纯化与测序：PCR产物的纯化与测序均委托上海派森诺生物科技股份有限公司进行，凝胶回收按照康宁生命科学(吴江)有限公司AxyPreP DNA凝胶回收试剂盒说明书进行，测序反应在3730XL DNA Analyser(ABI)测序仪上进行。

1.5 序列处理及分析

序列通过Chromas软件读取，并对每个测序结果进行人工逐碱基读取和反复校对，确保序列的高质量，序列整合处理用BioEdit软件，对齐处理用ClustalW Multiple Alignment软件。将确定好的序列利用NCBI中的BLAST进行相似性检索，进行比对和同源基因的下载，然后将自测序COⅠ基因序列以及从GenBank下载的象甲科害虫基因序列用DNAMAN软件进行多重比对，将比对结果保存为FASTA格式。利用DnaSP软件统计单倍型，序列相同作为同一单倍型(haplotype)，忽略插入与缺失位点。将比对结果导入MEGA软件，利用Kimura双参数法计算遗传距离[14]并计算转换和颠换值及其比值(R值)，保守位点及变异位点，并且应用K2P遗传距离模型的邻接法构建进化系统树，系统发育树分支的置信度采用自展法(bootstrap analysis BP)重复检测1 000次。

2 结果与分析

2.1 序列分析

2.1.1自测序列

通过对来自38个来源地的3种象甲样品的COⅠ基因进行扩增和测序，总共得到68条长度约为700 bp的清晰单一目标片段。在NCBI中利用BLAST进行同源性比对，结果表明，3种象甲COⅠ基因序列分别与数据库中靶标种类基因片段的同源性为99%～100%，与形态鉴定结果一致，表明所获得的COⅠ基因序列准确可靠。利用DnaSP软件统计单倍型，3种储粮象甲的单倍型情况见表2。米象包含H1、H2、H3、H4、H5和H66种单倍型，其中H1、H2、H3和H4分别为来源于澳大利亚、四川广汉、四川十陵和四川三台样品所特有，H5为11个来源地样品所共有，H6为9个来源地的样品共有；所有玉米象单倍型类型为H7，为13个来源地样品所共有；谷象含H81种单倍型。各种单倍型分布情况见表2，可以看出，单倍型类型和样品来源地之间没有关系。从各种单倍型中选取1个序列用于后续分析，具体序列为基因登录号为KY887564、KY887566、KY887567、KY887568、KY887569、KY887570、KY887571、KY887572的8条序列。

2.1.2GenBank获取序列

在GenBank中通过序列比对获取的3种象甲的COⅠ基因同源序列为：米象8条、玉米象86条、谷象3条，利用DnaSP进行单倍型统计，GenBank中3种象甲科储粮害虫COⅠ基因单倍型为：玉米象3种单倍型，米象2种单倍型，谷象1种单倍型，根据得到的单倍型，每种选取1个基因序列用于后续分析。另外在GenBank下载到象甲科储粮害虫的罗望子象COⅠ基因序列1条，阔鼻谷象COⅠ基因序列1条，GenBank中下载序列共9条(见表3)。以赤拟谷盗为外源种。

表3 NCBI上下载的储粮害虫CO Ⅰ基因单倍型数量及代表序列号

2.2 COⅠ基因序列组成和变异

自测序列和下载的序列剪切成等长426 bp片段，MEGA软件分析结果表明，未发现碱基的缺失和插入。变异位点193个，保守位点233个，简约信息位点126个，自裔位点55个。所有位点中，A、G、C和T的碱基平均含量分别为29.8%、14.7%、20.6%和35.0%，A+T含量较高，为64.7%，G+C含量35.3%，表现明显的A+T碱基偏嗜，且A与T含量相当，符合昆虫线粒体基因组成的基本特征[19]。

2.3 碱基替换分析

全体位点及各位点的转换与颠换值以及其比值结果如表4，全体位点的转换主要发生在T/C间，颠换发生在A/T间，转换/颠换为0.97。转换与颠换在密码子各位点发生比例接近，且转换与颠换值相当，第1，2和3位点的R(转换/颠换)值分别为1.04、0.85和1.03。无论整体还是密码子各位点，其R值都小于2，说明该段序列的转换与颠换未达饱和，构建系统发育树时应考虑转换与颠换发生的比率，另外说明该段基因可靠程度高，使用该基因构建进化树可靠。

表4 核苷酸碱基替换值

2.4 遗传距离分析

考虑碱基的转换与颠换，采用bootstrap值(1 000)进行检验，MEGA中的Kimura双参数法遗传距离计算结果见表5。

表5 象甲COⅠ基因序列Kimura双参数法遗传距离

由表5可知，种内和种间遗传距离存在明显差异。种内遗传距离为0.000～0.007，种内平均遗传距离为0.003 4，种间遗传距离为0.163～0.207，种间平均遗传距离0.193 2，本研究中3种象甲种间遗传距离是种内遗传距离的56倍，满足DNA条形码有效性的建议标准，与Hebert等[6]研究理论一致，认为98%的种内遗传距离差异为0～2%，种间遗传距离差异平均可达11.3%。

2.5 系统发育树的构建

利用邻接法对象甲COⅠ基因序列建系统发育树，聚类结果如图1。

由图1可以看出，3种象甲的同一种不同单倍型聚为一支，分支自展值均为100%，不同种的种类被明显区分开，聚类结果与形态学鉴定结果一致，说明该段序列能够作为3种象甲分子鉴定的依据。

3 讨论

米象、玉米象和谷象是3种重要的储粮象甲类害虫[2]，谷象因鞘翅无斑点、后翅退化、不能飞等特点易于米象与玉米象从形态上进行区分[2]，米象和玉米象通过形态鉴别非常困难，虽然二者可以通过个体大小、食性偏好、不亲和性、前胸背板和生殖器等加以区分[20]，但最可靠的是通过解剖它们的生殖器加以鉴别[20]，这对非从事分类的专业人员而言非常困难。随着分子生物学技术的发展，其在米象和玉米象的鉴别方面也得到广泛应用，Hidayat等[20]运用RAPD和RFLP技术对米象和玉米象进行了成功鉴别，但是这些方法可重复性差并且价格昂贵[21]，Peng等[22]通过设计引物扩增ITS-2区对实验室米象和玉米象品系进行了区分，然而他们并没对别的种群和该方法的有效性进行验证。

分支处数值表示重复1 000次后的自展值(>50%)，标尺示遗传距离。

在本研究中，利用DNA条形码技术成功对3种储粮象甲进行了种的区分，参照Napoleão等[23]的方法，通过分析目的片段种内和种间遗传距离，对将COⅠ基因作为3种储粮象甲种类鉴定的DNA条形码的有效性进行了分析和评估。好的DNA条形码种间变异应大于种内变异，COⅠ基因种间遗传距离平均值至少应该是种内遗传距离平均值的10倍[6]，本研究结果表明，研究所用COⅠ基因序列在储粮象甲种内保守，种间变异较大，所测样品种间遗传距离平均值约为种内遗传距离平均值的56倍，满足DNA条形码有效性的建议标准，与Hebert等[3]研究理论一致，可以将此段序列作为分析及鉴别3种象甲的依据。

陈光辉等[24]在对玉米象的DNA条形码研究中，通过基于K2P双参数模型构建的NJ树，实现了将DNA条形码用于玉米象的快速鉴别，本研究通过构建COⅠ基因NJ系统树，将玉米象、米象和谷象3种象甲聚为3个不同的小支，不同种类区别明显，进化树聚类结果和形态分类结果一致，实现了将DNA条形码用于米象、玉米象和谷象3个在形态上易混种的快速鉴别。

DNA条形码方法对3种常见储粮象甲的鉴定结果与经典形态鉴别方法鉴定的结果完全一致，证明了DNA条形码方法的有效性，与RFLP方法相比，根据Folmer等[18]COⅠ基因的DNA条形码方法可以提供更多的定量和数据库信息，方便更多的研究人员共享，而且，DNA条形码方法比RFLP更准确更稳定[25]。对研究人员和从业人员而言，通过获取简单序列并进行比对即可实现3种象甲的快速鉴别，便于检验检疫和害虫防治方面的实际应用[12]。Corrêa 等[26]利用从GenBank获得的玉米象COⅠ基因序列(基因登录号AY131100)和米象COⅠ基因序列(AY131099)设计种特异引物，对6个地理种群的48个个体进行了鉴别，从本研究的结果看(表2、表3)，不同种类象甲的COⅠ基因存在不同的单倍型，某些位点存在变异，Corrêa 等[26]仅根据一种单倍型设计特异引物用于种的鉴别存在局限性。参照前人的研究方法[15,17,27]，在后续研究中，可利用本研究所得的3种储粮象甲类害虫的基因序列，结合GenBank获取的序列，通过序列比对，针对不同种的特有碱基序列设计特异引物，可获得适用性强的种特异引物。

本研究表明，基于COⅠ基因的DNA条形码技术在象甲的分子鉴定上是有效的， DNA条形码技术方便、快捷、经济且准确，能解决储粮害虫形态鉴定存在的不足，在储粮象甲分子鉴定上具有可行性，同时本研究为储粮害虫DNA条形码技术的构建提供了理论依据及实践基础。