限制性胎盘嵌合体的妊娠与分娩结局

张妙莲, 李婳婳, 潘焯仪, 赵强

江门市中心医院产科、妇产儿生殖医学临床转化及应用重点实验室(广东江门 529000)

无创产前检测(non-invasive prenatal testing,NIPT)是近年发展最快的产前染色体疾病筛查手段,检测的是母体血浆中的胎儿游离DNA,主要来源于胎盘,因此NIPT所检测到的染色体异常可分为以下3种情况:(1)胎儿染色体及胎盘染色体均异常;(2)限制性胎盘嵌合体(CPM),即只有胎盘染色体异常,胎儿染色体正常;(3)真性胎儿嵌合体(TFM),即异常染色体只存在胎儿组织中,胎盘染色体正常。有部分研究认为,CPM与流产、胎儿生长受限、宫内死胎、孕高症等相关[1-3]。对于胎儿染色体异常,已有大量病例数据及研究以预测胎儿预后情况。但对于CPM,目前国内外关于胎儿妊娠结局的数据仍较少,对临床遗传咨询造成困扰。以往研究一般是通过产前绒毛检测意外发现的CPM,检出率约为1.9%[4],但随着NIPT在临床上的广泛应用,越来越多的CPM被检出。本研究回顾性分析CPM病例染色体检测结果,结合妊娠年龄、妊娠期合并症、胎儿出生后情况等病史资料,探讨CPM与不良妊娠结局的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 数据来源于2017年10月至2021年11月行NIPT结果提示异常,羊水染色体检测结果与NIPT结果不一致的孕妇的胎盘组织样本。剔除羊水染色体检测结果异常、拒绝产前诊断、胎盘留取或检测失败样本。剔除羊水染色体检测结果异常、拒绝产前诊断、胎盘留取或检测失败样本,共48例纳入研究。

研究经江门市中心医院伦理审查(江心医伦理审查[2023]42号)

1.2 方法

1.2.1 NIPT检测 抽取孕妇外周血约10 mL,离心采集血浆后提取胎儿游离DNA,使用胎儿染色体非整倍体(2号三体1、18号三体、13号三体)检测试剂盒,按照实验室标准操作规程进行文库制备,使用BGISEQ-500测序仪进行测序及数据分析。

1.2.2 染色体核型分析 抽取羊水20 mL或外周血3 mL,按照实验操作规程进行细胞培养(羊水双人双线操作)、收获、制片和G显带,使用全自动扫描仪分析系统扫描(德国蔡司),命名规则按照人类细胞遗传学国际命名体制标准。

1.2.3 CMA检测 抽取羊水10 mL提取基因组DNA,排除母血污染后,按照实验标准操作规程进行片段化、PCR扩增、纯化及标记,使用Cytoscan 750k芯片(美国Affymetrix公司)进行杂交。拷贝数目变异判读规则按照美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)和临床基因组资源机构(ClinGen)2019 年联合发布的共识建议。命名规则按照人类细胞遗传学国际命名体制标准。

1.2.4 胎盘染色体组织二代测序检测 新鲜胎盘冲洗干净后在胎盘子面及母面上、中、下各取3个黄豆大小胎盘组织,提取基因组DNA后,使用华大基因检测平台的低深度全基因组测序(CNV-Seq)进行检测。

2 结果

2.1 羊水染色体检测结果 根据产前诊断及胎盘染色体检测结果,分为CPM组及对照组。CPM组样本NIPT结果阳性,产前诊断染色体检测结果为阴性,但胎盘染色体检测结果提示染色体非整倍体。对照组为NIPT结果阳性,产前诊断及胎盘染色体检测结果均为阴性。CPM组有21例,对照组有27例样本纳入研究。

48例羊水细胞核型分析均未检出异常核型,CPM组21号样本CMA检出21q22.3区域存在1.69 Mb可能致病的缺失片段(表1),其余47例样本均未发现致病性拷贝数目变异或覆盖致病性印记基因的纯合区域(ROH)。

表1 22例CPM染色体检测及临床资料

2.2 胎盘染色体检测结果 CPM组21例样本胎盘验证结果均涉及染色体非整倍体,结果见表1,检出13号染色体三体5例(24%),7号染色体三体4例(19%),X染色体单体3例(14%),2号染色体三体2例(9.5%),X合并21号染色体单体1例,8号染色体三体、12号染色体三体、15号染色体三体、16号染色体三体、18号染色体三体、2号染色体三体0及2号染色体三体1各有1例。

2.3 CPM组及对照组妊娠情况分析 对照组孕妇妊娠年龄21～43岁,平均(31.43±5.02)岁,CPM组孕妇预产期年龄24～42岁,平均为(31.71±5.18)岁。对照组高龄妊娠有6例(22.22%),CPM组有7例(33.33%)。对照组孕妇在妊娠期间发生合并症的有5例(18.52%),1例子痫前期,2例为妊娠期糖尿病(GDM),1例妊娠期高血压,1例妊娠期血小板减少合并水肿。CPM组孕妇妊娠期合并症有6例(30.00%),4例GDM,1例重度子痫前期,1例血栓前状态。

2.4 CPM组及对照组妊娠结局 对照组无流产、宫内死胎或引产,1例胎儿右肾轻度分离(7.2 mm),1例羊水偏少,其余25例胎儿超声未见异常,27例新生儿顺利分娩。分娩时孕周为31.3～40.9周,平均孕周为(38.71±2.0)周。CPM组1例胎儿超声提示右手多指,3例提示羊水少,其中1例合并胎儿生长受限(FGR)。21号样本因羊水细胞检出21q22.3区域可能存在致病性缺失,孕妇坚决要求引产,其余20例新生儿均顺利分娩。CPM组分娩时孕周为35～41.3周,平均分娩孕周为(38.63±1.8)周(表2)。

表2 CPM组与对照组妊娠及新生儿出生情况分析

对照组新生儿出生体重1.25～3.68 kg,平均为(2.88±0.5)kg,平均出生体重Z-score为(-0.54±0.28)kg,小于胎龄儿(指出生体重<10%或<-2SD,SGA)有2例(7.41%),出生体重Z-Score分别为-3.01SD及-4.63SD。CPM组新生儿出生体重1.7～3.94 kg,平均为(2.88±0.5) kg,平均出生体重Z-score为(-0.48±0.36)kg,SGA有4例(20%)。4例SGA分别为16号染色体三体 1例(出生体重Z-Score: -2.61SD),13号染色体三体 1例(出生体重Z-Score: -3.29SD),嵌合X染色体单体2例(出生体重Z-Score分别为-2.79SD及-3.47SD)。

3 讨论

染色体嵌合的发生是由于有丝分裂错误导致,体细胞有丝分裂染色体不分离,导致三体细胞及单体细胞的形成,但常染色体单体细胞会迅速凋亡,X单体细胞则一般能存活,三体细胞也可能在后续复制中丢失一条染色体而恢复成整倍体细胞[5]。胚胎组织分化发生于受精早期,囊胚一小部分细胞分化为胎儿,其他细胞则分化为胚胎外组织,如胎盘。因此,染色体有丝分裂错误发生的时间对异常细胞在胚胎的嵌合部位及嵌合比例影响重大。根据异常细胞嵌合的部位不同,可分为3种情况,即CPM、TFM及胎儿染色体及胎盘染色体均发生嵌合。

CPM根据异常染色体细胞的分布,分为3型。CPM Ⅰ型异常染色体细胞仅限于细胞滋养层,CPM Ⅱ型异常细胞局限于绒毛间质核心,CPM Ⅲ型异常细胞同时分布在细胞滋养层及绒毛间质层。根据细胞分布可以推测CPM Ⅰ及CPM Ⅲ会造成NIPT结果假阳性,Ⅱ型则不会干扰NIPT结果[6]。Grati等[7]在952例CPM中发现Ⅱ型CPM发生频率最高,约46.73%,Ⅰ型及Ⅲ型分别占41.28%及11.97%。CPM Ⅰ及Ⅲ型三体细胞嵌合比例≥70%时,就有可能被NIPT检出[7]。

因为只有Ⅰ型及Ⅲ型CPM才会对NIPT造成假阳性结果,本研究只纳入Ⅰ型及Ⅲ型CPM作为研究对象。CPM中不同的异常染色体发生率差异大,有文献报道在395例Ⅰ型及Ⅲ型CPM中,非整倍体发生率最高的依次为X染色体单体、7号染色体三体、13号染色体三体、3号染色体三体及2号染色体三体[6]。本研究CPM组中,发生率最高的为13号染色体三体、7号染色体三体、X染色体单体及2号染色体三体,共15例(68%)。

孕妇高龄是非整倍体配子形成的高危因素,且年龄越大,染色体异常配子的发生率越高[8-10],因此高龄也可能是形成CPM的潜在因素。但有多个研究发现CPM组与正常胎盘妊娠年龄无明显差异[8-11],也有研究发现CPM Ⅲ组妊娠年龄更大[(39.7±2.6)岁vs. (37.1±3.2)岁][1]。本研究中CPM组与对照组妊娠年龄差异不大[(31.71±5.18)岁vs. (31.43±5.02)岁],但高龄妊娠比例CPM组要高于对照组(33.33%vs. 22.22%)。

胎盘在妊娠过程中发挥重要作用,一方面胎盘为胎儿提供发育所需的氧气及营养物质,同时清除代谢废物,另一方面胎盘有重要的内分泌功能,使母体环境适应胎儿的生长。CPM在临床上并不罕见,CPM的胎盘功能是否会发生改变,从而导致妊娠状态改变、胎儿发育异常及妊娠期合并症等目前结论尚不明确。有研究观察到CPM组妊高症及CPM Ⅰ型组SGA发生率明显高于对照组(10%vs. 2%、15%vs. 5%),而死胎、早产、先兆子痫和GDM的发生率则相似[1]。Tuohy等[12]报道分娩周数在正常胎盘与CPM (Ⅱ型+Ⅲ型)中差异无统计学意义,但在单独的Ⅲ型中分娩周数明显小于正常胎盘组[(35.7±3.77)周vs. (39.0±2.14)周]。值得注意的是,不同染色体非整倍体的CPM不良妊娠结局的发生率差别较大。多篇文献报道16号染色体三体的胎儿及CPM与子痫前期密切相关[13-14],13号染色体三体胎儿的孕妇罹患妊娠高血压疾病及子痫前期风险比普通孕妇高2～20倍[15-17]。Spinillo等[18]总结多个研究的病例,发现CPM早产风险及低出生体重儿(<2.5 kg)差异无统计学意义,但SGA发生率是对照组2.45倍,在16号染色体三体 CPM组SGA发生率是对照组11.64倍。Wolstenholme等[5]研究发现CPM组不良妊娠结局风险不会增加,但出生低体重儿及出生高体重儿明显增加。Eggenhuizen等[19]总结多篇文献发现,2、3、7、13、15、16 及22号染色体三体CPM与正常胎盘相比,发生FGR、早产、SGA风险明显增高。

本研究通过27例对照组及20例CPM组样本发现(第21例样本孕妇坚决要求引产),CPM组孕期未出现先兆流产、宫内死胎,产程顺利,新生儿Apgar评分均为10分。CPM组妊娠期合并症主要是GDM,重度子痫前期在CPM组发现1例,为13号染色体三体 CPM。但CPM组妊娠期合并症、胎儿超声异常及SGA发生率均比对照组高,其中CPM组SGA发生率更是对照组的3.13倍(20%vs. 7.41%),分别为1例16号染色体三体、1例13号染色体三体及2例X染色体单体CPM。文献[5]总结了80例CPM样本,发现只有16号染色体三体 CPM及2号染色体三体 CPM各有1例宫内死胎,其他染色体CPM均未发现现在流产和宫内死胎,FGR则在多种CPM中均能发现,包括16号染色体三体、13号染色体三体、2号染色体三体、15号染色体三体、X染色体单体、7号染色体三体等,与本研究样本的观察结果基本相符。7号染色体三体在CPM中较常见,有部分胎儿可有SGA。本研究有4例7号染色体三体,均是嵌合体,嵌合比例在37%～65%,推测50%左右嵌合型7号染色体三体CPM对胎盘功能影响较小,故未观察到SGA病例。与宫内死胎、妊娠期子痫及SGA高度相关的16号染色体三体及13号染色体三体 CPM[20-21],本研究受限于样本量,目前只能收集到1例16号染色体三体 CPM及13号染色体三体 CPM 5例。16号染色体三体 CPM孕期发现羊水少,无妊高症,新生儿出生体重为2.25 kg(-2.61SD),与Grau Madsen等[17]报道的1例16号染色体三体CPM症状相同,该例同样孕期羊水过少出生后发现SGA。涉及13号染色体三体的CPM有4例为嵌合型CPM,除1例发现GDM外,其余均未发现妊娠期合并症及新生儿异常。1例为13号染色体三体 CPM,新生儿右手多指且出生体重为2.12 kg(-3.47SD),目前未检索到关于13号染色体三体 CPM出现多指的文献病例报道。有3例胎儿超声显示羊水少(1例16号染色体三体 CPM、1例18号染色体三体 CPM及1例X染色体单体CPM。多篇文献报道,除了妊娠期高血压和子痫前期外,羊水减少或增多也常见于CPM病例中[19]。吴小青[21]发现1例13号染色体三体 CPM胎儿不仅有FGR还合并有大脑中动脉血流异常、左心室偏小、主动脉狭窄、羊水过少,1例2号染色体三体 CPM胎儿重度FGR,1例9号染色体三体 CPM胎儿FGR合并脐动脉阻力增高、大脑中动脉阻力减低、羊水减少、肠管回声增强。可见,羊水少在CPM中较常见。此外,CPM胎儿也是多器官先天畸形的高危人群[22-23]。Eggenhuizen等[19]总结了多个文献,发现2号染色体三体、5号染色体三体、13号染色体三体及22号染色体三体等CPM均有胎儿畸形病例报道,症状有NT增厚、小头畸形、摇椅足、脊柱畸形、FGR等,16号染色体三体 CPM胎儿畸形报道的病例最多,症状集中在单脐动脉、房室间隔缺损、NF增厚、颅面部畸形、尿道下裂。

文献报道,在一些特殊的情况下,如异常细胞在不同组织嵌合比例差异大、三体及单体自救等,即使羊水穿刺染色体检测,胎儿也可能由于低比例染色体非整倍体嵌合及单亲二体(UPD)导致印记基因疾病或隐性基因遗传病而发生先天性畸形[16]。本研究CPM组羊水均进行CMA检测,可以排除4例胎儿超声异常是由于胎儿组织存在UPD导致的隐性遗传病引起,但难以排除胎儿组织局部出现细胞非整倍体低比例嵌合而没有被羊水样本捕获到或者没有被CMA及核型分析检测到。

本研究显示CPM组妊娠期合并症、胎儿超声异常及SGA发生率均比对照组高,SGA发生率更是对照组的3倍。由于受限于样本量因素,并未进行统计学检验。上述研究结果也提示了通过NIPT意外发现的CPM,特别是对于13号染色体三体、16号染色体三体及X染色体单体CPM,孕期需要密切监测妊娠期间生化指标的变化及胎儿B超,注意胎儿生长发育。

利益相关声明:论文全体作者均知晓并同意论文投稿,并承诺无任何利益冲突。

作者贡献说明:全体作者均参与了论文形成的全程工作。通信作者赵强提出研究选题及指导论文撰写,张妙莲负责课题设计、论文撰写、数据分析工作,李婳婳和潘焯仪参与数据采集、数据处理和分析。