血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1抑制剂对大鼠创伤性股骨头坏死程度的影响*

高扬,董海鹏,王文娟,刘峰,刘超

石家庄市第三医院创伤一科(河北石家庄 050011)

股骨颈骨折内固定术后股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head,ONFH)是内固定术最严重的并发症,给患者带来了巨大的经济和心理负担。研究人员一直致力于减少或避免ONFH的发生。公认的内固定术后ONFH危险因素有股骨骨折Garden分型和复位质量[1-4]。此外,研究人员也发现了许多相关的ONFH危险因素,包括术前牵引[1-2]、植入物取出[5]、复位类型[6]、损伤机制[7]和损伤到手术的时间间隔[6,8]等。最近,研究报道一些血液生化标志物与非创伤性ONFH有关。低水平的1型胶原交联羧基端肽(CTX)和1型原胶原氨基端前肽(PINP)被认为是糖皮质激素诱导的ONFH的早期诊断生物标志物[9],白细胞介素(IL)-9和IL-33作为免疫和炎症相关分子在ONFH患者中的表达也显著增高[10-11]。此外,血清软骨低聚基质蛋白(COMP)、αMSH和胡萝卜素等在ONFH患者和对照组之间均有显著差异[12-14]。但是,很少有研究探究创伤性ONFN与血清学指标之间的关系。本课题组前期发现临床内固定术后血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)高水平状态是术后股骨头坏死的风险因素。PAI-1是重要的纤溶系统调控因子,可通过与组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)形成复合物来调节血浆和血管内皮细胞表面游离的活性t-PA的含量,进而阻止活性纤维蛋白的降解,使血液呈高凝状态[15]。因此,术后PAI-1高水平状态增加股骨头坏死风险的潜在机制可能是内固定术后过表达的PAI-1引起的高凝状态影响了局部血供,加重了股骨头局部缺血,最终诱发股骨头坏死。课题组结合前期研究认为缩短术后血浆PAI-1高水平持续状态可以有效促进股骨头局部血供重建,降低股骨头坏死程度。因此,我们在2022年1月至2023年1月期间使用大鼠创伤性股骨头坏死模型开展随机对照试验。通过PAI-1抑制剂和外源性PAI-1缩短或延长创伤后PAI-1的高水平持续时间,观察股骨头坏死情况,探究PAI-1抑制剂对创伤后股骨头坏死程度的影响。本研究旨在为临床治疗提供新的研究方向和思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本研究选取成年SD雄性大鼠60只,体重(350±50)g。实验动物饲养于河北省实验动物中心[SCXK(冀)2022-001],保持温度(23±1)°C,光照和黑暗循环各12 h,并给予充足食物和水。本研究经我院动物伦理委员会批准同意后实施(批准号:K20211218208)。

1.2 主要试剂及设备 PAI-1抑制剂毛两面针素(Toddalolactone)和Tiplaxtinin均购自MedChemExpress中国公司;外源性PAI-1也购自MedChemExpress中国公司;PAI-1 Activity Assay试剂盒购自美国abcam公司;eXplore Locus小动物活体microCT系购自美国GE Healthcare公司。

1.3 造模与分组 所有大鼠使用2%戊巴比妥(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉并放置于手术台上;待深度麻醉后,备皮并在右髋侧转子中心做长约2 cm切口,分离肌肉暴露髋关节;打开关节囊切断髋关节圆韧带;使用电凝法切断股骨颈周围血供,造成股骨头缺血[16]。术后使用生理盐水冲洗伤口,严密止血并分层缝合切口,术后5 d内注射氨苄青霉素[25 mg/(kg·d)]。大鼠苏醒后单独饲养于鼠笼,无进食及运动限制。将60只造模大鼠随机分为PAI-1抑制剂组、PAI-1组和空白对照组(每组20只)。各组大鼠建模6 h后开始给予相应干预。PAI-1抑制剂组大鼠在术后6 h给予抑制剂毛两面针素腹腔注射,1 mg/kg[17],1 d后给予抑制剂Tiplaxtinin灌胃,2 mg/(kg·d),持续4周。PAI-1组大鼠术后6 h给予外源性PAI-1腹腔注射,每3 d 1次,剂量为2.5 nmol/kg PAI-1所溶的生理盐水100 mL,持续4周[18]。空白对照组术后每3 d腹腔注射相同剂量的生理盐水。术后4周时对实验动物实施安乐死,并取右侧股骨头进行显微CT和HE染色检查。

1.4 血浆活性PAI-1检测 所有大鼠在术前、术后6、12、24 h和4周时分别采鼠尾静脉血进行血浆活性PAI-1检测。静脉血经离心(3 000 r/min,15 min)后得到血清1 mL置于1.5 mL离心管内。获得的血清采用PAI-1 Activity Assay试剂盒检测活性PAI-1含量。相关操作严格按照试剂盒实验流程进行。

1.5 显微CT观察股骨头影像学变化 使用显微CT扫描仪对所有大鼠右侧股骨头进行扫描,并采用GE Micro View软件分析数据[19]。观察指标为骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。

1.6 HE染色观察股骨头病理组织学改变 采集右侧股骨头标本进行组织病理学检查。标本固定在10%中性钙甲醛中7 d,然后用10%EDTA溶液脱钙28 d。脱钙和石蜡包埋后,制成5 μm厚的切片并进行HE染色。HE染色用于评估骨坏死情况,评估标准基于Dong等[20]的研究。当髓质造血细胞或脂肪细胞坏死、空腔陷窝或骨细胞核凝聚时,判断存在骨坏死。

1.7 统计学方法 所有统计分析均由GraphpadPrism 8.0软件执行。定量资料以均数±标准差表示,P<0.05为差异具有统计学意义。采用方差分析检验对满足正态分布和方差齐性检验的数据进行分析,不满足方差齐性的数据采用非参数检验进行分析。

2 结果

2.1 一般情况 本研究将60只雄性大鼠随机分配至PAI-1抑制剂组、PAI-1组和空白对照组,术前和实验结束时体重组间差异无统计学意义(P>0.05),表明术前动物基础情况均衡可比且术后恢复良好。实验结束时,PAI-1抑制剂组中2只大鼠出现术后出血,经治疗后出血停止。空白对照组1只大鼠术后出现感染死亡。余无特殊并发症。为保实验结论准确,以上3只大鼠未纳入数据统计。见表1。

表1 各组大鼠一般情况

2.2 各组大鼠血浆活性PAI-1含量比较 血浆活性PAI-1含量分析结果显示,与术前相比,空白对照组和PAI-1抑制剂组在术后6 h血浆活性PAI-1含量明显升高,而随着时间的延长,即术后12、24 h和术后4周,血浆活性PAI-1含量显著下降(P<0.01)。PAI-1组血浆活性PAI-1含量在术后6 h亦明显升高(P<0.01),但在术后12、24 h和术后4周血浆活性PAI-1含量无显著的降低趋势(P>0.05)。术前与术后6 h 的血浆活性PAI-1含量比较的结果显示,与空白对照组相比,PAI-1抑制剂组、PAI-1组差异无统计学意义(P>0.05)。但在术后12 h、24 h及术后4周时的血浆活性PAI-1含量比较结果显示,与空白对照组相比,PAI-1抑制剂组明显降低,PAI-1组显著升高(P<0.01);与PAI-1抑制剂组相比,PAI-1组在术后12 h、24 h及术后4周时的血浆活性PAI-1含量明显升高(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠不同时间点血浆活性PAI-1含量对比

2.3 各组大鼠骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁分离度比较 显微CT用于评估术后4周时各组大鼠创伤性股骨头坏死发生情况,结果显示:与PAI-1抑制剂组相比,PAI-1组和空白对照组骨小梁连续性中断、骨小梁稀疏、骨矿物质流失明显。各组股骨头骨体积分数(BV/TV×100%)的比较结果显示,与空白对照组相比,PAI-1抑制剂组显著升高(P<0.05),PAI-1组显著降低(P<0.05);与PAI-1抑制剂组相比,PAI-1组股骨头骨体积分数显著降低(P<0.05)。各组骨小梁厚度计算的结果显示,与空白对照组比较,PAI-1抑制剂组的骨小梁厚度显著升高(P<0.05),PAI-1组显著降低(P<0.05);与PAI-1抑制剂组相比,PAI-1组骨小梁厚度显著降低(P<0.05)。骨小梁分离度计算的结果显示,与空白对照组相比,PAI-1抑制剂组显著降低(P<0.05),PAI-1组显著升高(P<0.05);与PAI-1抑制剂组相比,PAI-1组骨小梁分离度显著升高(P<0.05)。见图1、表3。

图1 各组大鼠股骨头显微CT结果比较

表3 各组大鼠股骨头显微CT数据结果比较

2.4 各组大鼠股骨头病理组织学观察 股骨头HE染色表明,与空白对照组相比,PAI-1抑制剂组股骨头空骨陷窝和脂肪坏死发生率明显减少,PAI-1组明显增加。空骨陷窝率(空骨陷窝数/骨陷窝数×100%)的分析结果显示,且与空白对照组相比,PAI-1抑制剂组显著降低(P<0.05),而PAI-1组显著升高(P<0.05);与PAI-1抑制剂组相比,PAI-1组空骨陷窝率显著升高(P<0.05)。各组大鼠股骨头的脂肪组织面积比较结果显示,与空白对照组比较,PAI-1抑制剂组明显降低(P<0.05),而PAI-1组显著升高(P<0.05);与PAI-1抑制剂组相比,PAI-1组脂肪组织面积显著升高(P<0.05)。见图2、表4。

表4 各组大鼠股骨头HE染色数据结果比较

3 讨论

ONFH是一种股骨头血供被破坏进而导致骨坏死的病理过程,是骨科最具挑战性的疾病之一。为追寻更好的治疗方法和治疗材料,研究人员需要开展各种基础和临床试验,在这个过程中,可靠的股骨头坏死动物模型十分重要。合适、可靠的动物模型可以反映病理条件下体内微环境的变化,在一定程度上反映人类疾病的进展。股骨头坏死动物模型可分为非创伤性和创伤性两类[21],本研究采用大鼠创伤性股骨头坏死模型[16]。建模过程中的手术创伤与临床中内固定手术创伤相似,而对股骨颈周围血管的阻断与股骨颈骨折对血管的影响相似。因此,本研究中的创伤性模型可以很好地模拟临床中股骨颈骨折内固定术的损伤要素,反映病理条件下患者内固定术后的体内生理变化。此外,PAI-1主要通过影响局部血运增加股骨头坏死风险,激素或酒精诱发的非创伤性模型无法用于探究PAI-1与股骨头坏死的关系。因此,选择合适的创伤性动物模型是获得可靠研究结论的基础。

研究发现,患者创伤后早期血浆PAI-1分泌明显升高并与损伤严重程度有关。在Hayakawa等[22]的研究中,大鼠受到严重钝性创伤后3 h时血浆PAI-1含量约为98 ng/mL,可达到非创伤组大鼠的180倍。而Wu等[23]发现,大鼠多发创伤后4 h血浆PAI-1可升高至33 ng/mL。两项研究结果的差异说明创伤严重程度与血浆PAI-1分泌水平相关,较高的PAI-1可能意味着更加严重的创伤。Carter等[24]模拟了大鼠双侧股骨骨折条件,发现手术组和假手术组血浆PAI-1水平在术后6 h和12 h时有统计学差异,而在24 h时无统计学差异。因此,本研究中建模后6 h血浆PAI-1水平(PAI-1抑制剂组64.95 ng/mL、PAI-1组64.84 ng/mL,空白对照组65.31 ng/mL)与建模过程中的创伤程度相匹配,且空白对照组术后PAI-1变化符合正常创伤后生理趋势。

本研究中,PAI-1抑制剂组在术后加用PAI-1抑制剂后,血浆活性PAI-1含量显著降低,缩短了高PAI-1水平持续时间,且显微CT和组织染色结果表明大鼠股骨头坏死程度显著下降。与之相对的,PAI-1组大鼠在术后加入外源性PAI-1延长了高PAI-1水平时间,且大鼠股骨头坏死情况更加严重。这些结果表明血浆活性PAI-1是术后股骨头坏死的重要风险因素之一,且PAI-1抑制剂可有效降低股骨头坏死发生风险。1963年研究人员首次报道了纤溶酶原激活剂抑制物PAI-1。PAI-1通过减少纤维蛋白降解抑制了纤溶系统,进而促进血栓形成。因此,它是血管事件进展过程中的关键蛋白,与心肌梗死、脑卒中、深静脉血栓形成和微血管血栓密切相关[25]。这些血管事件对内固定术后患者来说都是引发股骨头坏死的直接风险因素。术后使用抑制剂减少血管血栓形成,是改善股骨头血供降低坏死风险的重要措施之一。此外,研究还发现PAI-1还是肥胖、糖尿病和代谢综合征的生物学标志物[26]。肥胖患者脂肪细胞中PAI-1 mRNA和血浆PAI-1含量分别是正常人的2倍和6倍。研究人员给肥胖动物模型服用PAI-1抑制剂后观察到动物体重降低和脂肪细胞体积减少[27]。因此,长期服用PAI-1抑制剂对于降低肥胖诱发的股骨头坏死风险具有积极作用。相类似的,PAI-1与高血压、糖尿病和高胆固醇血症之间的密切联系也提示PAI-1抑制剂可能有着良好的研究前景。

综上所述,PAI-1抑制剂既可以通过术后早期抑制PAI-1分泌直接抑制血栓形成,进而改善股骨头血供降低坏死风险,又可以通过长期服用缓解肥胖、高血压、糖尿病和代谢综合征等疾病来间接降低股骨头坏死风险。然而,尽管本研究进行了严格的对照试验,但仍存在一定局限性。首先,术后6 h给予PAI-1抑制剂时有2只大鼠发生出血并发症,因此更加安全的抑制剂类型和治疗时间点的选择仍需进一步研究。其次,动物研究的结论仍需临床验证才能真正指导临床实践,使患者临床受益。

在大鼠模型中,血浆活性PAI-1是创伤性骨头坏死的重要风险因素之一,且使用PAI-1抑制剂可以有效降低大鼠血浆活性PAI-1含量,降低大鼠创伤后股骨头坏死程度。本研究为进一步的临床研究提供了坚实的实验基础。但是,新型抑制剂的开发仍需进一步研究。

利益相关声明:本文所有作者声明无利益冲突。

作者贡献说明:高扬负责实验设计和论文初稿的写作; 董海鹏和王文娟负责方案执行和数据收集;刘峰负责数据分析处理;刘超负责论文修改。