慢性HBV携带者共病抑郁症患者血清miRNA-22的表达*

张婷婷,刘依蕙,叶烨,侯彩兰,王诗镔,黄春霞,贾福军△

1南方医科大学附属广东省人民医院(广东省医学科学院)、广东省精神卫生中心心理科(广东广州 510180); 2广东三九脑科医院检验科(广东广州 510510)

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球范围内的公共卫生问题,乙型肝炎的慢性感染被认为是最重要的传染病之一,可导致严重的后果[1]。全球有超过2.4亿人感染HBV,其中15%～40%的HBV感染者未经治疗可进展为肝硬化,可能导致肝功能衰竭和肝癌[2]。抑郁症(major depressive disorder,MDD)患病率高、自杀风险高和识别率低[3],被认为是HBV相关肝病患者中最常见的精神疾病之一,并且对疾病进展有不良影响[4]。miRNA是由约22个核苷酸形成的小的非编码RNA(ncRNA)分子。它们与靶信使RNA(mRNA)的3′非翻译区(UTR)结合,导致翻译抑制,进而抑制靶mRNA表达[5]。有研究认为miRNA参与基因表达的调控机制,并深度参与精神疾病的神经生物学基础,包括抑郁症和精神分裂症[6-7]。因此miRNAs在基础和临床神经学中属于有前景的分子,miRNAs不仅提供了新的诊断标记物,也成为新治疗方法的极具吸引力的潜在的治疗靶点[8-9]。据报道[10-11]miRNA-22(miR22)是一种高度保守的非编码RNA,其通过与靶基因的mRNA结合,调控基因的表达,与细胞生存、减轻氧化应激损伤或促进细胞周期停滞或诱导细胞凋亡密切相关,已被发现在多种生物学过程中起着重要的调控作用。如抑郁症患者突触功能的改变与miRNA的异常表达密切相关,包括miR22-3p等[12-13],有研究[14]显示miR22等在精神疾病的发病机制以及抗精神病药和情绪稳定剂的作用机制中起重要作用。Zhu等[15]研究显示建议将miR22和miR26a组合作为最稳定的参考基因集,用于在HBV患者和健康人群中进行循环miRNA评估。因此,miR22可能与乙型肝炎共病抑郁有关,以往抑郁症多有精神专科医师排查诊治,能有表观遗传基因检测进一步提高诊治精准性。本研究通过检测人类血清中miR22的表达量,讨论抑郁症发病机制与miR22之间的可能关系,尤其是HBV携带者患抑郁症的机制以及临床检测的意义,以期待提高乙型肝炎患者患抑郁症早期诊治及防范。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究中所有研究对象为2020年11月至 2022年12月期间,在广东省精神卫生中心和广东三九脑科医院门诊或住院患者和志愿者中招募。共收集了120例受试者,其中慢性HBV携带者共病抑郁症患者(共病组)25例,抑郁症患者(抑郁组)35例,慢性HBV携带患者(携带组)30例以及健康对照受试者(健康组)30例,并收集了120份血清样本。研究经过广东省人民医院医学研究伦理委员会通过(CDREC2018408)。知情同意书由受试者本人或监护人签署。所有受试者均由精神科中级及以上职称医师面诊问诊、量表评估和标本收集。所有研究者均接受的相关培训,顺利完成晤谈。

1.2 疾病的诊断标准和入组标准

1.2.1 诊断标准 抑郁症诊断符合国际疾病分类法(International Classification of Diseases,ICD-10)抑郁症的诊断标准;HBV携带者诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》2015更新版的慢性HBV携带者诊断标准。

1.2.2 入组标准 所有受试者均符合以下:(1)年龄18～60 岁;(2)排除近1个月应用免疫调节剂及干扰素、核苷(酸)类似物等抗病毒药物或治疗;(3)非妊娠、哺乳期受试者;(4)愿意参加研究。各组需要同时符合以下入组标准。

共病组:(1)诊断抑郁症,且首次发作;(2)符合诊断慢性HBV携带者,既往未治疗;(3)既往无慢性HBV携带者外的其他心身疾病。

抑郁组:(1)诊断抑郁症,首次发作;(2)既往无心身疾病。

携带组:(1)诊断慢性HBV携带者,既往未治疗。(2)既往无慢性HBV携带者外的其他心身疾病。

健康组:既往无心身疾病。

1.3 试剂及仪器 miRNA 提取试剂(Magen); HiPure Liquid RNA Mini Kit(Magen厂家);HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA 试剂盒(Vazyme厂家)。荧光 PCR 仪:Bio-Rad厂家,CFX96 型号。

1.4 方法

1.4.1 标本采集与处理 (1)使用无抗凝管采5 mL外周静脉血样,采血后轻轻将全血滴入洁净的离心管;(2)4℃下静置3～4 h,可见血块析出(也可放置4℃冰箱过夜);(3)使用 5 000 r/min,离心10 min,可见淡黄色血清,取出上清后可再3 000 r/min离心10 min,以最大程度保证血清质量;(4)将血清分装,在医院-40℃保存4 h内转送,或直接转送至实验室冻存于-80 ℃。

1.4.2 荧光定量PCR检测(探针法)进行miRNA-22检测

1.4.2.1 miRNA提取 样本解冻后振荡混匀,使用Magen厂家生产的HiPure Liquid RNA Mini Kit提取总RNA(里面包含miRNA)。

1.4.2.2 反转录cDNA 使用用Vazyme厂家生产的HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA 试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA,具体如下:(1)去除基因组 DNA:配制好反应液(5X gDNA wiper Mix 2 μL;Total RNA 10 pg 1 μg、RNase free dH2O up to 10 μL)进行基因组 DNA去除反应,反应条件:42℃ 2 min;4℃ ∞;(2)反转录反应体系:反应液:上一步的反应液 10 μL,Hiscript Ⅲ Enzyme Mix 2 μL,Gene Specific Primer 0.2 pmol,10X RT Mix 2 μL、RNase Free dH2O up to 20 μL;配置反应液进行逆转录反应;(3)采用RT 反应程序:37℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃ END,反转录产物(cDNA)做荧光 PCR;(4)反转录引物序列见表1。

表1 反转录引物序列信息

1.4.2.3 荧光定量 PCR 上机检测 以cDNA为模板,使用KAPA生产的KAPA Probe Fast qPCR Master进行qPCR检测。qPCR 反应体系如下(单位μL,共 20 μL体系):ddH2O 6.7 μL,KAPA Probe Fast qPCR Master Mix(2×)10 μL,10P Primer F 1.0 μL,Universal R 1.0 μL,cDNA 1.0 μL,Probe 0.3 μL;反应程序:模板 cDNA 预变性:95℃ 3 min;荧光 PCR:95℃ 3 s,55℃ 30 s,读荧光数值,40 循环;30℃ 30 s;miRNA-22的引物和Typrobe共同探针序列见表2。

表2 miRNA-22引物和Typrobe共同探针序列信息

1.4.2.4 miR22的相对表达量计算 以U6为内参,采用2-ΔΔCt法与参照样本比较计算相对表达量。每个样品设置 3 个复孔,取均值。

1.5 统计学方法 对于数值型变量,采用均值±标准差表示,对于分类型变量,采用频数和百分比表示。若数值型变量服从正态分布,则采用方差分析比较组间差异,若不服从正态分布,则采用Kruskal-Wallis检验。当组间存在差异时,进行两两比较,并采用Bonferroni法对P值进行校正。对两个数值型变量 进行相关性分析时,若满足正态分布,则采用Pearson法,否则采用Spearman法。以2个基因数据为因变量,以人口学特征、临床特征和心理特征为自变量,分别构建单因素线性回归模型。若单因素线性回归模型显示某自变量有统计学意义,则纳入多因素线性回归模型。应用方差膨胀因子(VIF)评估多因素线性回归模型的多重共线性,当VIF<5,表示无共线性。检验水准α为0.05。分析采用R 4.0.2软件实现。

2 结果

2.1 基本人口学特征 共纳入研究对象120例,其中共病组25例,抑郁组35例,携带组30例,健康组30例。年龄为(37.56±12.22)岁,其中抑郁组的平均年龄分别低于共病组、携带组和健康组(P<0.001),其余组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。120例中女性与男性组间差异无统计学意义(P=0.20)。拥有高中及以上学历与初中及以下学历组间差异无统计学意义(P=0.16)。组间比较发现抑郁组的未婚率分别高于共病组、携带组和健康组,其余组间差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 共病组、抑郁组、携带组和健康组的社会人口学特征比较 例(%)

2.2 miR22表达量

2.2.1 miR22-3p表达量 miR22-3p表达量平均值为4.31±11.67,组间差异有统计学意义(P<0.001),其中共病组(15.18±22.67)远高于抑郁组(1.77±1.45)、携带组(1.70±1.11)和健康组(0.82±0.50)。抑郁组与携带组的差异无统计学意义(P>0.05),但均高于健康组(P<0.05)。见表4、图1。

注:NS表示无意义,*表示P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

表4 各组miR-22表达量及组间比较

2.2.2 miR22-5p表达量 miR22-5p表达量平均值为3.20±10.72,组间差异有统计学意义(P<0.001),其中共病组(11.85±21.60)远高于抑郁组(1.07±1.49)、携带组(1.15±0.83)和健康组(0.53±0.35),差异有统计学意义(P均<0.001)。抑郁组与携带组、健康组的差异无统计学意义(P>0.05),但携带组高于健康组(P=0.002)。见表4、图2。

注:NS表示无意义,*表示P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.3 miR22-3p基因的影响因素分析 以miR22-3p基因表达量为因变量,构建单因素和多因素线性回归模型。单因素回归模型结果显示仅临床诊断类型有统计学意义,无需进行多因素模型校正。相对于健康组(0.82±0.5),共病组miR22-3p基因的表达量(15.18±22.67)更多(β=14.35,95%CI:8.85～19.85,P<0.001),健康组与携带组、抑郁组miR22-3p基因的表达量差异尚无统计学意义,见表5。

表5 miR22-3p基因的单因素和多因素线性回归模型结果

表6 miR22-5p基因的单因素和多因素线性回归模型结果

2.4 miR22-5p基因的影响因素分析 以miR22-5p基因表达量为因变量,构建单因素和多因素线性回归模型。单因素回归模型结果显示仅临床诊断类型有统计学意义,故无需进行多因素回归分析。相对于健康组(0.53±0.35),共病组miR22-5p基因的表达量(11.85±21.60)更多(β=11.33,95%CI:6.09～16.56,P<0.001)。健康组与携带组(1.15±0.83)、抑郁组(1.07±1.49)miR22-5p基因的表达量与抑郁组差异尚无统计学意义。

3 讨论

通过对受试者血清中miR22的表达进行定量PCR检测,我们发现miR22在慢性HBV携带者共病抑郁症患者中表达水平显著高于其他3组(P<0.01)。抑郁组与携带组的差异无统计学意义,其中miR22-3p抑郁组与携带组表达量均高于健康组(P<0.05),miR22-5p携带组高于健康组(P<0.05)。有文献报道在急性缺血性卒中、脑干和脑深部微出血病患中,血浆 miR22表达量较高的患者更可能发生卒中抑郁(PSD)[16];另有研究[17]表明通过苹果酚类提取物可以减轻 miR22-3p/SIRT1 轴的氧化应激及炎症和细胞凋亡从而改善小鼠铅诱导的认知障碍以及抑郁和焦虑样行为;另miR22-3p已被证明参与MDD背景下突触可塑性的调节[18]。以上结果提示miR22在抑郁症中发挥重要作用。本研究结果发现miR22在抑郁及乙肝共病中表达差异,提示miR22在抑郁及抑郁共病中发挥作用,但具体分子机制仍需进一步研究。

首先,本研究结果表明miR22可能在慢性HBV携带者共病抑郁症中发挥重要作用,miR22也可能参与抑郁症形成的机制。这也与既往研究发现相符合。抑郁障碍的发病机制尚不完全清楚,miR22通过调控多个信号通路,如神经发育、炎症反应和神经递质的合成等,参与了抑郁症的发病过程可能;如miR22可能在抑郁症的发病中起到了调控神经递质的作用,miR22可以通过抑制多巴胺和5-羟色胺的合成和释放来影响神经递质的水平[19-20],这可能导致神经递质的不平衡,从而引发抑郁症的发病。同时有研究发现,miR22通过调控多个靶基因,如脑源性神经营养因子(BDNF)、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)和B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)等[17,21-23],影响神经元的生存和功能,从而参与了抑郁症的发病过程。再有,miR22可能参与了抑郁症患者中神经发育和突触可塑性的调节。研究显示miR22通过抑制神经元的分化和突触的形成,从而影响脑神经的发育和功能。老年性痴呆大鼠海马中miR22表达可抑制神经元凋亡,从而改善学习和记忆功能障碍[23]。本研究未发现抑郁症组miR22基因表达改变有统计学意义,miR22-5p在抑郁症组中表达量低,一是考虑样本量较少,二是可能有其他分子作用于miR22-5p,具体机制仍需进一步研究。进一步的研究可以探究miR22与抑郁症的关联机制,以及其在疾病发展过程中的作用。

其次,既往已有研究表明,miR22的表达水平可以作为HBV感染相关肝病的治疗预测指标,其表达水平与HBV感染相关肝病的临床治疗效果密切相关[24-26]。也有研究发现,通过调节miR22的表达水平,可以改善抑郁症动物模型中的行为表现[17],miR22可作为一种潜在的治疗靶点[27-28],本研究结果提示HBV携带共病抑郁症患者血清中的miR22表达量显著异常,提示临床未来有望将检测miR22用于评估两种疾病共病患者的治疗和预测疾病的进展,以期待提高对HBV感染和抑郁症患者的早期诊治及防范。

最后,本研究存在一定局限性,抑郁组比其他组有更低的平均年龄和更多的未婚状态,在其他3组没有发现这样的差异。既往有研究显示就诊于精神专科医院的抑郁症患者年龄和首次发作年龄均低于综合医院就诊的患者[29](P<0.05),本研究受试者来源的两家机构收治患者均属为专科院区,且进行中未进行年龄匹配,未来研究可能对年龄及结婚与否因素再匹配扩大样本量进行研究。

综上所述,本研究发现为进一步研究miR22在慢性HBV携带者共病抑郁症的发病机制和治疗效果以及炎症反应调控中的作用机制提供了重要线索。未来的研究可以进一步探究miR22的生物学功能和临床应用前景,以期为慢性HBV携带者共病抑郁症的诊断和治疗提供新的靶点和策略。

利益相关声明:本研究所有作者均无利益冲突。

作者贡献说明:张婷婷负责课题设计、撰写论文、实施研究和数据收集;刘依蕙、叶烨、王诗镔、黄春霞参与实施研究、统计学分析、文献资料整理和数据收集;侯彩兰、贾福军负责方案指导及论文审校。