口腔上皮细胞具核梭杆菌表达与口腔鳞状细胞癌患者病情及预后的关系*

周丽凤,蒋霞,张蓉蓉,王丽,梁巧梅

1湖南中医药大学第二附属医院口腔科(湖南长沙 410005); 2湖南中医药大学第二附属医院重症医学科(湖南长沙 410005)

口腔上皮作为咀嚼黏膜、黏膜和特化黏膜的一部分,提供了将口腔软组织与外界环境隔开的屏障,这一屏障是许多功能和结构蛋白相互作用的结果,这些相互作用导致能够对许多外源性(可能是有毒的)影响作出反应[1]。上皮细胞能够通过产生大量的细胞因子、黏附分子、生长因子、趋化因子和基质金属蛋白酶对外界刺激做出反应[2]。具核梭杆菌(Fn)是一种革兰阴性专性厌氧细菌,属于梭杆菌属,通常寄生于口腔、泌尿生殖道、土壤、肠道和上消化道,但最常寄生于口腔菌斑中[3]。Fn一直被视为人体正常菌群的组成部分,由于从临床样本中连续分离出细菌,Fn引起了研究人员的关注,并被认为是一种不容忽视的细菌[4]。研究显示Fn是一种机会性病原体,具有很强的致病性,在口腔和全身感染中经常检测到Fn,它与各种人类疾病相关,例如牙周炎、心绞痛、肺脓肿、慢性中耳炎、鼻窦炎、扁桃体周围脓肿等[5]。不仅参与炎症过程,而且还参与癌症的进展,其中包括口腔鳞状细胞癌(OSCC),结直肠癌(CRC),食管鳞状细胞癌(ESCC)和乳腺癌等[6]。对肿瘤内核分枝杆菌与OSCC肿瘤之间的关系知之甚少。此外,据报道,Fn通过Toll样受体(TLR)2-4信号传导调节其他癌症(主要是结直肠癌),特别是巨噬细胞和T调节细胞(Tregs)的局部免疫力[7]。因此,本研究主要探索口腔上皮细胞具核梭杆菌预测口腔鳞状细胞癌患者的预后价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究招募了本院2018年12月至2022年4月151例OSCC患者,本研究经本院伦理委员会批准,所有患者均书面同意参加本研究。患者的纳入标准为:所有患者均确认了组织学诊断为OSCC;排除在治疗开始前2周内接受过抗生素治疗;有急性牙周炎或口腔念珠菌病;在治疗开始时有一个鼻胃管;以及患有免疫功能低下疾病(如糖尿病,艾滋病毒等)的患者。

1.2 基因组基因和总核糖核酸提取 在手术后立即将肿瘤样品冷冻在冷冻管中的液氮中,并在温度控制下储存在-80℃。分别使用5～40 mg和10～50 mg的肿瘤片段进行RNA提取,在4～5 μm冷冻切片上评估,并将肿瘤细胞少于50%的样品排除在研究之外。根据以下方案在大解剖的肿瘤区域进行核酸提取,蛋白酶K消化后,根据供应商的建议,使用miRNeasy迷你试剂盒奇亚根提取总RNA。

1.3 实时定量PCR分析Fn状态 定量值由开始检测到荧光信号随PCR产物指数增长而增加的周期数(周期阈值,Ct值)获得。检测由ABI Prism 7900HT序列检测系统的激光探测器执行,根据制造商手册使用PE Biosystems分析软件。基因组DNA的精确数量(基于光密度)及其质量(即缺乏广泛降解)都很难评估。在JUN含量的基础上将Fn水平归一化,用作人类二倍体对照。结果以Fn 16S rRNA基因拷贝数的n倍差异表示,称为“Nfn”,确定为Nfn=2ΔCtsample,其中样本的ΔCt值为Fn 16S rRNA基因的平均Ct值减去二倍体对照基因的平均Ct值。Fn Ct值<32为Fn阳性,Fn Ct值>32为Fn阴性。对于Fn阳性肿瘤,将Nfn值归一化,使Ct值为32=1,即Fn 16S rRNA基因拷贝数的最小精确量化量。

利用Oligo 6.0计算机程序设计了Fn 16S rRNA基因DNA序列引物(Upper 5′-AGCGTTTGACATCTTAGGAATGA-3′和Lower 5′-GCCATGCACCACCTGTCTT-3′)和JUN (Upper 5′-CACGGCCAACATGCTCAGG-3′和Lower 5′-GCATGAGTTGGCACCTGT-3′)。Fn引物对的选择是相对于梭杆菌种密切相关的家族成员16S rRNA基因序列唯一的。使用Power SYBR 绿色预混液进行实时定量 PCR,热循环条件是初始变性步骤在95℃下进行10 min,后在95℃下循环50次,持续15 s,65℃/60℃循环1 min,分别进行JUN/Fn,后进行熔融曲线步骤。通过熔解曲线分析证实了扩增特异性。

1.4 实时定量逆转录PCR的免疫相关基因表达分析 RNA在20 μL含1X RT缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl (pH=8.3);75 mg氯化钾;3 mmol/L MgCl2),10 mmol/L DTT,100单位RNase H活性降低的SuperScript Ⅱ逆转录酶),0.5 mmol/L每个dNTP,0.15 μg/μL随机引物(Life Technologies),20单位RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promeg),1μg总RNA)的最终体积中反转录,热循环条件为随机引物在25℃杂交10 min,42℃合成cDNA 30 min,99℃灭活逆转录酶5 min,4℃冷却。所有实时荧光定量PCR反应均使用Power SYBR绿色预混液使用ABI棱镜7900HT序列检测系统进行。热循环条件是在95℃下初始变性步骤10 min,然后在95℃下循环50次15 s,65℃下1 min,后是熔融曲线步骤。通过熔解曲线分析证实了扩增特异性。

1.5 免疫组化 使用CD163和LPS抗体进行免疫组化分析。最初诊断时获得的石蜡包埋组织块从居里研究所诊断和治疗医学系的档案中检索。用切片机从石蜡包埋的OSCCs组织块中切割3 μm厚度的切片,组织切片通过二甲苯和乙醇洗涤进行脱蜡和复水:(1)在0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中提取抗原,在高压锅中(4 min)。(2)将切片用3%过氧化氢甲醇浸泡15 min,后用清水和PBS冲洗,阻断内源性过氧化物酶活性。(3)与靶向抗原的一抗孵育。(4)用识别兔和小鼠免疫球蛋白的生物素偶联二抗配方进行免疫检测,后用过氧化物酶标记的链霉亲和素,并与兔生物素化抗小鼠免疫球蛋白G抗体(DAKO SA)连接。(5)用DAB显色并用梅氏苏木精26反染色。所有免疫染色均使用徕卡BOND RX研究自动免疫染色装置进行处理,用半定量评分解释抗lps抗体免疫染色(0=阴性,1=弱染色,2=中染色,3=强染色)。对肿瘤细胞和非肿瘤细胞进行半定量评价(0:无细胞,+:<5%,++:5～25%,+++:> 25%)。用抗cd163抗体免疫染色的巨噬细胞百分比也用以下评分进行半定量评估:组织学评分(HS):HS 0:无阳性细胞;Hs 1 (+):150%。

1.6 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行分析,组间差异通过独立样本t检验分析,采用Spearman秩相关非参数检验确定Fn与免疫相关基因水平的关系。用Kaplan-Meier法估计存活分布,用log-rank检验确定生存率差异的显著性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者的人口统计学 本研究共收集了151例OSCC患者,患者大多是男性(61.6%),中位年龄为57岁(范围22～78岁),≥56岁占70.2%,不饮酒者占61.2%,但吸烟者占55.1%,HPV阴性者占97.4%,PN 0阶段占53.6%,UICC第四阶段肿瘤占42.4%。124个(82.1%)样本Fn呈阳性,与年龄较大(≥56岁:74.2%vs.51.9%,P=0.021)、饮酒者较少(34.9%vs.60.0%,P=0.034)和淋巴结受累频率较低(PN 0阶段,58.1%vs.33.3%,P=0.001 6)有关,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 患者的人口统计学 例(%)

2.2 Fn与OSCC总生存期(OS)的关系 为了获得OSCC总生存期(OS),Fn阳性肿瘤患者的结局明显优于27例Fn阴性肿瘤患者的结果(HR:0.51,P=0.009 4;5年OS 60.5%vs.37.7%,10年OS 47.9%vs.18.8%)差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

图1 Fn与OSCC总生存期(OS)的关系

2.3 Fn与无复发(RFS)和无转移生存期(MFS)的关系 为了获得Fn与无复发(RFS)和无转移生存期(MFS)的关系,本研究发现142例患者对疾病复发具有研究价值。Fn阳性肿瘤患者(35.5%vs.51.8%,P=0.11)的疾病复发频率降低的不显著趋势,与Fn阴性肿瘤相比,局部区域性(70.5%vs.53.3%,P=0.041)与转移性复发相比更明显,见表1。

根据Fn状态的RFS和MFS曲线如图2所示。与Fn阴性肿瘤相比,Fn阳性肿瘤与显着更长的RFS(中位数:7.06vs.2.11个月,P=0.009 1)和MFS(9.71vs.3.54个月,P=0.001 6)相关,差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 Fn与无复发(RFS)和无转移生存期(MFS)的关系

2.4 Fn与免疫相关基因mRNA表达的关系 为了探索Fn阳性肿瘤良好预后的潜在机制,本研究观察到Fn阳性与B淋巴细胞(CD20,P=0.027),T辅助淋巴细胞(CD4,P=0.013),M2巨噬细胞(CD163,P=0.020)和成纤维细胞(PDGFRβ,P=0.006 7)的标志物之间存在显着的负相关关系。Toll样受体(TLR)4(P=0.020)和OX40配体(TNFSF4)(P=0.006 7)表达在Fn阳性的肿瘤中显着降低。TNFSF9受体(TNFRSF9)的表达随着核细胞负荷的增加而增加,以及促炎细胞因子IL-1β(P=0.020)。Fn阳性与TNFSF4、TNFSF9、IL1B 和 CD163 表达水平之间的相关性如图所示。差异有统计学意义(P<0.05),为了验证细菌和免疫细胞(尤其是巨噬细胞)之间的相互作用,进行了免疫染色,以使用抗脂多糖(LPS)抗体和抗CD163标记M2巨噬细胞来检测细菌。结果表明具有高(或低)CD163和Fn RNA水平的肿瘤分别显示高(或低)CD163和LPS表达,CD163和LPS表达水平之间呈负相关,见图3、4。

注:A:CD163和LPS免疫染色在CD163高/LPS低病例,LPS:轻微表达;Fn阴性;B:CD163低/LPS高病例,LPS:强表达;Fn阳性

图4 Fn与免疫相关基因mRNA表达的关系

3 讨论

口腔细菌菌群在维持健康的口腔生理环境中起着至关重要的作用,口腔微生物组的变化与癌症有关,最近,已经证明在肿瘤组织中也发现了细菌,即所谓的“肿瘤内”微生物群[2]。Fn是口腔的常见细菌之一,已被确定为口腔疾病(如牙周炎和口腔癌)的潜在病原细菌[8]。本研究在评估了肿瘤内Fn与临床病理特征以及OS,RFS和MFS在两个独立的OSCC患者队列中的相关性,并探索了核福菌与众所周知的免疫相关基因之间的相互作用。结果发现Fn鉴定了OSCC的一个亚组,在年龄较大的不饮酒患者中更常见,与较低的淋巴结浸润和远处复发相关,Fn阳性肿瘤患者的结局明显优于Fn阴性肿瘤患者,与RFS和MFS结果相关。

研究显示Fn与生存率之间呈正相关,因为细菌通常与癌症的预后不良有关,特别是在结直肠癌中,Fn可调节癌症的局部免疫力[9]。此外研究显示Fn通过结合宿主受体,调节宿主信号通路和细胞因子网络来黏附并侵入口腔上皮细胞,诱导宿主的炎症环境并促进炎症因子和丝氨酸蛋白酶的分泌,破坏免疫炎症平衡并破坏牙周组织,慢性感染与癌症风险增加有关[10]。本研究评估了Fn与各种免疫相关基因表达之间的关联,以探索Fn阳性肿瘤有利预后的潜在机制。结果发现,具有高Fn的肿瘤显示出低水平的M2巨噬细胞(CD163),CD4淋巴细胞,成纤维细胞(PDGFRβ),TLR4,OX40配体(TNFSF4)和TNFRSF9,以及高水平的TNFSF9和IL-1β。免疫组化分析证实,革兰氏阴性(LPS阳性)细菌(包括Fn阳性)与CD163阳性细胞呈负相关。

在大多数研究中,Fn感染被证明可以扩增骨髓来源的免疫细胞和Tregs,促进巨噬细胞的M2极化,诱导促肿瘤炎症,从而抑制T细胞增殖并诱导T细胞凋亡,它还通过Fap2等蛋白质直接抑制细胞毒性T细胞活性[11]。TLR是一系列受体,参与微生物制剂的检测,以诱导炎症和抗菌先天免疫应答的激活,TLR4是一种在巨噬细胞和肿瘤细胞表面表达的受体,并且参与了Fn的这些促炎/免疫抑制活性[12]。相关研究显示在肠道炎症的小鼠模型中,TLR2/TLR4敲除诱导核霉菌的定植增加和包括IL-1β在内的促炎细胞因子的产生[13]。在本研究中,观察到Fn阳性与低水平的TLR4和M2巨噬细胞有关。另一项研究表明,Fn增强了TNFSF9/IL-1β信号传导,诱导了M1巨噬细胞极化,M1极化缺乏影响可以通过伴随TNFSF9受体的降低[14]。炎症和M2浸润被发现与OSCC的预后不良有关[15]。本研究结果发现在TNFSF9和IL-1β细胞因子的表达水平之间观察到的核细胞负荷呈正相关。但该研究有以下局限性。本研究为单中心、小样本研究,其结论需要在多中心、大样本研究中得到证实。

综上所述,Fn阳性与年龄较大、较少饮酒和吸烟及较低的淋巴结侵犯频率有关,Fn阳性肿瘤的复发率较低,与Fn阴性肿瘤相比,转移性复发较少,OS、无复发和无转移生存期明显更长。免疫相关基因和免疫组化分析显示Fn载量与M2巨噬细胞呈负相关。Fn相关OSCC具有特定的免疫微环境,在老年、不饮酒的患者中更常见,预后良好,为其治疗提供了一定的指导意义。

利益相关声明:本文所有作者声明不存在任何利益冲突,本文中所有研究结果未在任何杂志发表过。

作者贡献说明:周丽凤负责了论文的全部撰写和进行研究设计;张蓉蓉、王丽、梁巧梅负责实施了本文中病例收集、数据统计等;蒋霞在论文撰写修改、讨论以及研究设计中都有巨大贡献。