血清miR-21、miR-150的表达与心房颤动患者NT-proBNP水平的关系及治疗前后变化分析*

范燕宾, 李雪博, 程帅, 孙运, 赵育洁, 陈丰毅

郑州市心血管病医院(郑州市第七人民医院)心血管内科(河南郑州 450000)

心房颤动(房颤)属于临床常见的心率紊乱疾病，近年来发病率呈现升高趋势，患者以快速、无序心房电活动为主要特征，病死率较高，对患者生存质量产生严重的影响。射频消融术是目前临床治疗房颤的主要方法，通过点对点模式加热组织造成细胞坏死，但是患者术后可能发生相关并发症，同时也会出现复发[1]。近年来研究发现房颤的发生同非正常调控离子通道蛋白引发电重构相关[2]。微小RNA属于内源性非编码小分子RNA，主要通过与相对性mRNA部分碱基发生配对阻止翻译，继而对基因转录表达进行调控。另有研究发现miR-21、miR-150在心室重塑过程中具有调控作用，可以对心肌纤维化、细胞肥大、细胞凋亡中的信号通路进行靶向调控，但是目前临床对于射频消融术治疗后患者血清微小RNA变化报道临床较为少见。本研究分析射频消融术治疗房颤患者体内血清微小RNA(miR-21、miR-150)变化情况，目的是了解微小RNA在房颤发生维持的分子机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年4月至2021年2月我院心内科确诊的103例房颤患者设为房颤组，选取同期来我院体检的健康人士作为对照组。研究经我院伦理委员会审批通过(2019-03-01)，受试者及家属知情同意。两组基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组的基线资料比较

房颤患者入选标准：(1)符合《心房颤动：目前的认识和治疗建议(2021)》[3]相关诊断标准，根据24 h动态心电图结果确诊，P波消失，代之以小而不规则的基线波动,形态与振幅均变化不定，频率约350～600次/min。心室率不规则。当心室率过快， QRS 波增宽变形。且记录到的房颤心电图持续时间≥30 s。(2)均在我院接受了射频消融术治疗，且手术成功。排除标准：(1)急性心肌梗死病史；(2)血液系统疾病；(3)精神疾病或痴呆患者；(4)癌症患者；(5)甲状腺功能异常；(6)近2周内使用影响本研究结果相关药物(血管紧张素转换酶抑制剂、β受体阻滞剂等)。

1.2 实时荧光PCR技术 抽取两组受试者全血标本，3 000 r/min离心10 min，转移至离心管后12 000 r/min离心10 min，获取200 μL血浆，采用美国MRC Gene公司提供的试剂盒获取总RNA，准备溶解好血清血浆样本，加入5倍体积的QIAzol Lysis Reagent吸打混匀，将装有裂解液的管子在室温静置5 min，加入3.5 μL mi RNeasy Serum/Plasma Spike-In Control 充分混匀，加入与起始样本等量的氯仿，振荡15 s，4℃下12 000 r/min离心15 min，将水相转入一个新的收集管加入1.5倍体积无水乙醇，反复吸打几次充分混匀，吸取700 μL样本，加在收集管，室温下12 000 r/min离心15 s加入700 μL Buffer RWT室温下12 000 r/min离心15 s，加入14 μL RNase-freewater在膜中心，1 min下全速离心洗提RNA，将提取出的RNA在微量核酸测定仪 Nano Drop 2000 上测定其浓度和纯度，挑选260/280比值在1.8～2.0的样品。取含100 ng总RNA按iScript TM cDNASynthesis Kit 操作说明书进行反转录cDNA。按TaqMan MicroRNA Assays 说明检测成熟miRNA，以江苏斯卡来特然生物技术制造厂提供的miR-21mimic、miR-150mimic和阴性对照为模板，miR-21mimic、miR-150mimic荧光探针作引物扩增，加入10 μL SYBR Green Enzyme、0.8 μL miR/U6 speaific primer set、2 μL cDNA，再加入ddH2O直至20 μL，在ABI StepOneTMReal-Time PCR System中进行反应(预变形1个循环，温度95℃，时间3 min；PCR反应40个循环，温度95℃，时间12 s)。所有实验重复3次，相对定量用2-ΔΔCt法来分析real-time PCR的结果。

1.3 NT-proBNP水平的检测 抽取两组受试者空腹静脉血3 mL，2 000 r/min离心30 min，采用莱恩德公司提供的LD-96A酶联免疫测试仪测定血浆NT-proBNP浓度变化，方法为酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，ELISA试剂盒由南京建成生物制品有限公司提供，试剂盒名称为N末端脑钠肽前体/N末端前脑钠肽试剂盒。

1.4 射频消融治疗 患者麻醉满意后穿刺股静脉，置入10极和4极标测导管到冠状静脉窦与右心室心尖，穿刺房间隔后显示肺静脉形态与走形，定位肺静脉口，按照患者电生理检查结果采取环肺静脉电隔离或环肺静脉电隔离联合多线性消融方法，消融过程中最高温度不得超过50℃，最大射频能力不超过50 W，单点消融时间低于60 s，局部电压低于0.1 mV可以终止消融治疗。消融成功标准为窦性心律或者冠状静脉窦起搏可记录到传导阻滞。患者术前服用华法林(1片/d，根据INR值调整剂量，国药准字H31022123，上海上药信谊药厂有限公司)抗凝治疗3个月，维持国际标准化率在2.0～3.0，术前3 d改为低分子肝素[1支/次，2次/d,国药准字J20180036，赛诺菲(北京)制药有限公司]皮下注射，术中采取普通肝素(100 IU/kg，术中维持ACT在250～350，国药准字H51021209，成都市海通药业有限公司)静脉维持，消融治疗后给予盐酸贝那普利片(国药准字H20030514，北京诺华制药有限公司)，1片/d；琥珀酸美托洛尔缓释片(国药准字H32025391，阿斯利康制药有限公司)，1片/d；螺内酯片(国药准字H31021273，上海医药信谊制药总厂)，1片/d。长期服用。定期复查血常规、肝肾功能电解质、凝血、心电图及心脏彩超；根据患者复查结果调整患者术后用药情况。

2 结果

2.1 两组血清miR指标、NT-proBNP水平比较 房颤组患者miR-21、NT-proBNP水平均高于对照组，miR-150水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组血清miR指标、NT-proBNP水平比较

2.2 不同类型房颤患者血清miR指标、NT-proBNP水平比较 103例房颤患者中，确诊为阵发性房颤组患者80例、持续性房颤患者23例，持续性房颤患者的miR-21、NT-proBNP水平均高于阵发性房颤患者，miR-150水平均低于阵发性房颤患者。差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同类型房颤患者血清miR指标、NT-proBNP水平比较

2.3 血清miR指标与NT-proBNP水平相关性 房颤患者miR-21与NT-proBNP呈正相关性(r=0.604，P<0.001)。miR-150与NT-proBNP呈负相关性(r=-0.627，P<0.001)。

2.4 射频消融前后患者血清miR指标、NT-proBNP水平比较 103例房颤患者均接受射频消融术治疗。治疗后3个月患者的miR-21、NT-proBNP水平显著低于治疗前，miR-150水平显著高于治疗前。差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 射频消融前后患者血清miR指标、NT-proBNP水平比较

2.5 治疗后12个月内复发与未复发患者miR指标比较 随访12个月，复发20例，复发患者治疗前的miR-21高于未复发患者，miR-150低于未复发患者(P<0.05)。见表5。

表5 复发与未复发患者miR指标比较

2.6 血清miR指标预测患者射频消融术后复发的价值 miR-21预测房颤射频消融术后复发的AUC值为0.737(95%CI:0.625～0.850)；miR-150预测房颤射频消融术后复发的AUC值为0.696(95%CI:0.550～0.842)。

3 讨论

房颤是临床常见的心律失常类型，国人中80岁以上的老年人群房颤发生率高达10%，随着病情进展在左心耳形成血栓，一旦栓子发生脱落会导致体循环栓塞，因此致残率和病死率较高，对患者生命安全产生严重的影响[4]。目前认为房颤发生是多因素造成，一方面心房内存在折返是房颤发生和维持的必要条件，主要同心房结构重构和电重构有关，心房肌细胞跨膜离子流的改变是电重构的病理基础，随着房颤持续时间的延长，心房心肌细胞超微结构及其细胞外基质发生改变，导致心房结构重构[5]。近年来临床分析与房颤相关的微小RNA研究较多，微小RNA属于内源性非编码的小分子RNA，通过和mRNA部分碱基发生配对引发降解或者组织其翻译过程，进而对基因转录后表达进行调控[6]。有报道指出微小RNA在心血管疾病发生发展中参与重要病理生理进程与疾病密切相关，尤其是可以参与房颤钾离子通道的重构改变[7]。

本研究在房颤患者中miR-21表达升高。有研究发现miR-21与心肌细胞肥厚、血管平滑肌增殖相关，有学者分析了心肌缺血再灌注患者中发现miR-21靶基因为人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)，miR-21可以在心肌成纤维细胞内通过转录后对PTEN水平下调，通过介导体内基质金属蛋白酶2表达上调参与到心肌梗死患者梗死区域胶原代谢和心室重构过程[8]。还有研究发现在房颤患者心房组织中miR-21表达异常及对相应的介导离子通道蛋白及心肌胶原代谢蛋白的调控分别参与电重构、结构重构过程，促成常心房组织向房颤发生及维持的易感基质转变，是房颤患者发生电重构、结构重构的重要机制之一[9]。

本研究还发现miR-150表达降低，miR-150在人体19号染色体定位，一般在淋巴结和脾脏等免疫系统中表达升高，研究发现miR-150低表达同炎症反应和心肌纤维与电重构之间相关，miR-150参与了人体组织纤维化过程，可以对胶原分泌产生影响，而纤维化发生会造成心脏结构重构，引发房颤发生[10]。我们对房颤患者分型发现，持续性房颤患者的miR-21、NT-proBNP值高于阵发性房颤患者，而miR-150值低于阵发性房颤患者。我们认为阵发性房颤患者病情相对轻，炎症恢复较快，心肌纤维化导致的心脏结构重构方面能在某种程度上得到缓解，导致miR-21、miR-150、变化不一致，持续性房颤由于结构重构情况较重，且纤维化程度严重，因此表现出miR-21表达更高，miR-150表达下降程度更大[11]。

NT-proBNP是世界公认的心肌损伤标志物,能够有效反映患者心功能。相关性分析可知miR-21、miR-150同患者NT-proBNP水平具有一定的关联性。相关研究发现miR-21、miR-150参与房颤期间心肌组织的电重构、离子重构和结构重构调控，主要针对细胞内钙超载、心房中局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活以及心房肌组织纤维化、通道和受体蛋白质变化，因此可以通过多途径参与上述因素的调节，最后表现为促房颤或抗房颤、促凋亡或抗凋亡等，同本研究结果基本一致[12]。

本研究采用射频消融治疗房颤患者，通过电隔离肺静脉，使肺静脉与心房组织产生隔离环，肺静脉内的放电无法到达心房组织，从而不会引起心房组织放电[13-16]。本研究还发现射频治疗后miR-21表达降低，miR-150表达升高，说明微小RNA变化情况也可以对患者射频治疗后NT-proBNP水平变化进行评价，进而可以反映患者心功能变化情况。而且绘制ROC曲线发现，miR-21、miR-150预测房颤射频消融术后复发均有一定的诊断价值。有研究发现，射频消融房颤前后外周血中miR-150的表达水平存在显著差异，术后明显增加，术前明显减少，可能是miR-150的调节导致术前房颤易感性增加，心房纤维化增加，术后心房重构发生逆转，与本研究结果基本一致[17-18]。

综上所述，miR-21高表达、miR-150低表达与房颤患者NT-proBNP水平升高有关，射频消融术治疗后患者的miR-21降低、miR-150升高，并且与房颤患者治疗后复发有关。

利益相关声明：本文所有作者共同认可论文无相关利益冲突。

作者贡献说明：范燕宾进行了论文起草，李雪博、程帅、孙运、赵育洁进行了论文修改与指导，范燕宾进行了数据分析，范燕宾和陈丰毅进行了数据提取、删失及标化处理，范燕宾进行了文献查阅。