早期糖尿病肾病患者血清lncRNA MIAT和miR-361-3p的关系*

李春, 张颖裕, 彭慧芳

河南科技大学第一附属医院 1内分泌科， 2内分泌遗传代谢实验室(河南洛阳 471023)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者常见的微血管特异性并发症，已成为导致终末期肾病的第二大病因[1]。早期DN以微量白蛋白尿为特征，并逐渐进展为大量白蛋白尿，血清肌酐和尿素氮水平升高，随着疾病进展将导致终末期肾病发生，DN占终末期肾病的30%～47%，也是导致死亡的主要诱因[2]。此外，糖尿病引起的肾功能损伤还会增加心血管疾病和中风等风险。既往研究显示，非编码RNA(ncRNA)通过调节炎症、细胞凋亡、自噬、细胞增殖和其他病理过程参与DN发病机制，ncRNA被认为是DN的治疗靶点或生物标志物[3]。长链非编码RNA(lncRNA)心肌梗死相关转录本(MIAT)在DN患者肾组织中上调表达，参与系膜细胞增殖和纤维化，以及介导高糖诱导的足细胞损伤过程[4-5]。微小RNA(miR)-361-3p在高糖处理的人肾小管上皮细胞(HK-2)中下调表达，参与HK-2细胞氧化应激损伤[6]。本研究通过观察早期DN患者血清lncRNA MIAT和miR-361-3p表达水平，探讨两者异常表达与该病的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取河南科技大学第一附属医院2020年6月至2021年9月收治的130例2型糖尿病患者，均符合中国2型糖尿病防治指南(2017年)[7]诊断标准，并进一步依据尿白蛋白/肌酐比值(UACR)将患者分为微量白蛋白尿(MA)组(UACR 30～300 mg/g，61例)，正常白蛋白尿(NA)组(UACR<30 mg/g，69例)。对照组(65例)为体检健康者。其中，NA组男、女分别35、34例，年龄(57.15±8.52)岁；MA组男、女分别32、29例，年龄(57.48±8.95)岁；对照组男、女分别34、31例，年龄(56.90±9.36)岁，3组间性别(2=0.049，P=0.976)、年龄(F=0.066，P=0.936)差异无统计学意义，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准(2022-07-B023)。

排除标准：(1)UACR >300 mg/g或终末期肾病者；(2)非2型糖尿病引起的肾脏疾病史；(3)合并急慢性感染；(4)急性高血糖紊乱；(5)肾功能损伤病史。

1.2 临床资料及试验方法 研究对象均在入院时统计以下基线资料：性别、体质指数(BMI)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、收缩压(SBP)、年龄、空腹血糖(FPG)、糖尿病病程、尿素氮(BUN)、舒张压(DBP)、肌酐(Scr)、总胆固醇(TC)、空腹胰岛素(FINS)、糖化血红蛋白(HbA1C)、UACR、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。其中，胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FINS×FBG/22.5。肾小球滤过率(eGFR)计算采用改良MDRD公式，175×Scr-1.234×年龄-0.179×(女性×0.79)[8]。

1.3 qRT-PCR技术检测血清lncRNA MIAT和miR-361-3p表达水平

1.3.1 lncRNA MIAT表达水平的检测 使用血清总RNA提取试剂盒(货号：B0901，新海基因公司)提取总RNA，在nano-800+超微量核酸蛋白分析仪(型号：JP-nano3000，上海金鹏分析仪器有限公司)上检测RNA浓度和质量，使用逆转录试剂盒(货号：R312-01，诺唯赞公司)得到cDNA；利用定量PCR试剂盒(货号：Q421-02，诺唯赞公司)配制反应体系10 μL，并在CFX384 Touch检测仪器(Bio-Rad)上进行PCR反应。以GADPH为内参，采用2-ΔΔCt法检测lncRNA MIAT表达水平。

1.3.2 miR-361-3p表达水平的检测 取血清样品，miRNA抽提试剂盒(货号：B1804，新海基因公司)得到总miRNA，取2 μg RNA按照逆转录试剂盒(货号：MR101-01，诺唯赞公司)以及定量试剂盒(货号：MQ101-01，诺唯赞公司)说明书操作，将混合液在CFX384 Touch定量仪器上进行PCR反应。见表1。

表1 引物序列

1.4 统计学方法 使用SPSS 25.0统计软件，以P<0.05为差异有统计学意义。计数资料以例(%)表示，组间比较行2检验。计量资料以表示，3组间比较行one-way ANOVA检验，组内两两比较行LSD法。Pearson法分析miR-361-3p与lncRNA MIAT以及BMI、UACR、TC等临床指标的相关性。多因素logistic回归分析影响miR-361-3p的因素。血清lncRNA MIAT、miR-361-3p诊断早期DN价值利用受试者工作特征(ROC)曲线，曲线下面积(AUC)比较采用Z检验。

2 结果

2.1 一般资料比较 3组在TC、Scr、BUN方面差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比，MA组的BMI、UACR、TC、SBP、HOMA-IR、FPG、TG、DBP、FINS、LDL-C、HbA1C水平明显升高，HDL-C、eGFR水平均下降(P<0.05)；与NA组相比，MA组糖尿病病程、SBP、FPG、FINS、HOMA-IR、UACR水平明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 3组一般资料比较

2.2 血清lncRNA MIAT和miR-361-3p表达水平比较 3组血清lncRNA MIAT和miR-361-3p表达水平结果显示，对照组、NA组及MA组血清lncRNA MIAT表达水平依次升高，miR-361-3p表达水平呈依次降低趋势(P<0.05)。见表3。

表3 3组间血清lncRNA MIAT和miR-361-3p表达水平分析

2.3 MA组血清lncRNA MIAT和miR-361-3p表达水平的相关性 生物信息学预测结果显示，lncRNA MIAT与miR-361-3p存在结合位点(图1)。相关性分析显示，MA组血清lncRNA MIAT与miR-361-3p表达水平呈负相关(r=-0.628，P=0.000)，见图2。

图1 lncRNA MIAT序列中含有与miR-361-3p互补的核苷酸序列

图2 MA组血清lncRNA MIAT和miR-361-3p表达水平的相关性

2.4 血清miR-361-3p表达水平与临床指标相关性 血清miR-361-3p与HOMA-IR、TC、HbA1C、FINS、UACR、FPG呈负相关，与HDL-C、eGFR呈正相关。见表4。

表4 miR-361-3p与各临床指标相关性

2.5 多因素logistic回归分析影响miR-361-3p表达水平的相关因素 以miR-361-3p表达水平中位数为界限，将其转换为二分类变量，以FPG、UACR、TC、eGFR、HbA1C、HOMA-IR、lncRNA MIAT、FINS、HDL-C为自变量，纳入logistic回归分析，发现FINS、FPG、lncRNA MIAT是miR-361-3p的独立影响因素，见表5。

表5 多因素logistic回归分析影响miR-361-3p表达水平的相关因素

2.6 血清lncRNA MIAT和miR-361-3p诊断早期DN的效能 血清lncRNA MIAT诊断早期DN的AUC为0.895(95%CI：0.838～0.952)，截断值取1.87时，对应特异度为82.60%，敏感度为88.50%；miR-361-3p诊断早期DN的AUC为0.874(95%CI：0.815～0.933)，截断值取0.71时，特异度为72.50%，敏感度为86.90%；lncRNA MIAT与miR-361-3p联合诊断的AUC为0.943(95%CI：0.900～0.986)，敏感度为95.10%，特异度为88.40%。AUC比较显示，lncRNA MIAT与miR-361-3p比较的Z=0.434、P=0.664，lncRNA MIAT与联合比较Z=2.783、P=0.005，miR-361-3p与联合比较Z=2.788、P=0.005。见图3。

图3 血清lncRNA MIAT和miR-361-3p诊断早期DN的ROC曲线

3 讨论

糖尿病是一种常见的慢性终身性疾病，仅在2019年该病导致超过150万人死亡，且其发病率仍在持续增加[9]。DN是糖尿病常见并发症，近年来DN发病率呈上升趋势，疾病晚期通常需要透析或肾移植，增加了全因死亡和经济负担[1]。DN具体分子机制尚不清楚，目前仍缺乏有效治疗方法[10]。一系列研究表明，非编码RNA中的lncRNA、miRNA参与DN肾小球足细胞损伤、肾小管上皮细胞损伤、肾小球系膜细胞增殖和纤维化、微血管病变、炎症反应等过程，与DN的发生、发展密切相关，且部分非编码RNA也被提议作为DN无创诊断标志物和治疗靶点[11]。

lncRNA MIAT参与微血管功能障碍等多种疾病过程[12]。近期，Ji等[4]研究发现，lncRNA MIAT在DN患者肾活检组织中上调表达，能够靶向抑制miR-147a，介导E2F3表达，进而诱导系膜细胞增殖和纤维化。而系膜细胞是肾小球重要组成部分，系膜细胞中增殖的失调和细胞外基质积累有助于DN进展。本研究通过qRT-PCR技术检测了61例微量白蛋白尿患者(MA组)、69例正常白蛋白尿患者(NA组)及65例健康对照组血清中lncRNA MIAT表达变化，结果发现与对照组相比，NA组中血清lncRNA MIAT表达水平明显升高；与NA组相比，MA组血清lncRNA MIAT表达水平明显增高，提示lncRNA MIAT的表达水平增高可能对DN进展起着积极推动作用。足细胞附着在肾小球基底膜(GBM)外侧，与内皮细胞和GBM一起形成肾小球滤过屏障；足细胞损伤是DN发生、发展的关键因素，DN损伤后足细胞形态学变化包括足细胞肥大、足细胞上皮间质转分化、足细胞脱离和足细胞凋亡以及足细胞自噬的功能改变[13]。有学者利用高糖(30 mmol/L)培养小鼠足细胞，发现lncRNA MIAT表达水平升高，通过调控p38MAPK磷酸化介导高糖诱导的足细胞损伤过程，特异性敲除lncRNA MIAT表达能够缓解足细胞损伤[5]。此外，lncRNA MIAT还可以与miR-130b-3p结合来增强足细胞损伤和G2/M期阻滞，而抑制lncRNA MIAT通过恢复裂隙隔膜完整性、防止去分化和抑制G2/M期阻滞，改善足细胞损伤和有丝分裂异常[14]。以上研究说明，lncRNA MIAT虽为非编码RNA，但其通过调控靶标miRNA，参与DN过程中的系膜细胞增殖和纤维化、足细胞损失和有丝分裂过程，在DN中扮演重要角色。目前，lncRNA MIAT诊断DN的效能还鲜有报道，本研究采用ROC曲线分析lncRNA MIAT对早期DN的诊断价值，发现lncRNA MIAT单独诊断早期DN的AUC为0.895(95%CI：0.838～0.952)，说明lncRNA MIAT有作为临床诊断早期DN标志物潜能。

有关miR-361-3p的研究主要集中于在非小细胞肺癌、透明细胞肾细胞癌、宫颈癌、甲状腺癌等恶性肿瘤中发挥抗肿瘤作用[15]，而糖尿病及其并发症中miR-361-3p功能研究较少。Huang等[16]发现高糖处理的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中miR-361-3p表达水平减少，能够特异性结合SOCS3，负调控SOCS3，从而抑制HUVECs细胞凋亡，阻止炎症因子分泌，表明miR-361-3p参与DM血管内皮损伤。此外，miR-361-3p的异常表达与脂肪酸介导的胰岛素抵抗和博莱霉素诱导的肺纤维化有关[17]。目前，早期DN血清中miR-361-3p表达变化还未有报道。本研究利用qRT-PCR技术证实miR-361-3p在早期DN患者血清中呈现低表达，说明miR-361-3p的下调参与DN形成过程。另有研究发现，miR-361-3p过表达后能够抑制淀粉样β蛋白诱导的细胞损伤、炎性反应及氧化应激[18]。近期，柳越等[6]发现miR-361-3p在高糖处理的人肾小管上皮细胞(HK-2)中下调表达，过表达后能够减弱HK-2细胞氧化应激损伤和细胞凋亡。本研究中，miR-361-3p与临床指标UACR存在负相关，与eGFR存在正相关，说明在2型糖尿病进展为早期DN过程中，miR-361-3p下调表达，同时UACR升高，eGFR降低，提示miR-361-3p对早期DN进展有阻止作用。糖代谢紊乱、炎症反应、胰岛素抵抗也是DN进展的病理机制。本研究中miR-361-3p与FPG、TC、HbA1C、FINS、HOMA-IR存在负相关，与HDL-C呈正相关，且FPG、FINS是miR-361-3p降低的影响因素。而FPG、FINS是临床检验中常用的血糖、胰岛素指标，对FPG、FINS水平检测可以准确、直观反映出机体血糖、胰岛素水平[19]。这说明miR-361-3p与早期DN进展中的胰岛素抵抗、糖脂代谢有关。

lncRNA可以作为“核酸海绵”，通过吸附靶miRNA来影响基因表达和下游信号通路。已有研究显示，lncRNA MIAT能够直接靶向miR-182-5p，促进GPRC5A表达，从而进一步影响高糖处理的HK-2细胞的NF-κB通路和生物学行为(增殖、凋亡和炎症)[20]。miR-361-3p在DN中受lncRNA MALAT1靶向调控，介导高糖环境下血管内皮细胞炎症[16]。基于此，通过生物信息学分析发现，lncRNA MALAT1与miR-361-3p存在互补核酸序列，血清中二者表达水平存在负相关性，且lncRNA MALAT1是导致miR-361-3p表达水平降低的影响因素，本研究推测lncRNA MALAT1还可能通过与miR-361-3p结合，可参与调控DN中的血管内皮细胞炎症或足细胞损伤等过程。目前，DN诊断指标包括UACR、eGFR，但二者稳定性均不足，Scr和尿素在早期肾功能障碍中特异性欠缺，部分患者在DN进展中不会出现微量白蛋白尿或肌酐改变[21]；GFR评估较为费力，导致临床使用受限；肾活检具有侵入性，因此仍需要筛选能够用于临床无创诊断且敏感、特异性生物标志物[22]。本研究ROC曲线分析显示，miR-361-3p诊断早期DN的AUC为0.874(95%CI：0.815～0.933)，lncRNA MIAT与miR-361-3p联合诊断的AUC为0.943(95%CI：0.900～0.986)；进一步比较AUC，发现lncRNA MIAT或miR-361-3p单独诊断的AUC比较差异无显著性，lncRNA MIAT、miR-361-3p单独诊断与联合诊断的AUC比较差异有统计学意义，说明lncRNA MIAT与miR-361-3p联合可用于临床诊断早期DN。

综上所述，早期DN患者血清lncRNA MALAT1表达水平增加，miR-361-3p表达水平降低，二者呈负相关，lncRNA MALAT1是miR-361-3p降低的影响因素，二者联合诊断早期DN效能较佳，可能参与早期DN病理过程。本研究不足之处在于：首先，单中心研究，样本量较少，限制了研究结果的普适性，仍需要扩大样本量、扩大研究对象范围进一步明确研究结果。其次，本研究仅通过生物信息学发现lncRNA MALAT1与miR-361-3p存在互补核酸序列，然后利用Pearson相关性证实二者具有明显负相关性，但二者在DN中的具体调控机制仍有待后续细胞实验等明确。

利益相关声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献说明：李春：提出研究方向、设计研究方案、实施研究过程、撰写论文；张颖裕、彭慧芳：收集数据、分析整理数据、修订论文；张颖裕：审阅论文、指导研究。