lncRNA TUG1在溃疡性结肠炎患儿血清中的表达及意义

王璐, 张媛, 罗静, 彭韶, 盛光耀

郑州大学第一附属医院儿科(河南郑州 450052)

儿童溃疡性结肠炎是发生在直肠与结肠的炎症性肠病[1]。临床研究发现，溃疡性结肠炎患儿肠黏膜组织内存在免疫炎症细胞浸润，如单核巨噬细胞等，其主要症状为腹痛、腹泻、便血等，严重时会出现消化道穿孔、肠梗阻等[2-3]。近几年，随着我国人民生活方式改变，儿童溃疡性结肠炎的发病率逐年上升，且与成人相比，儿童更易出现较为严重的溃疡性结肠炎，病情易迁延不愈[4]。目前溃疡性结肠炎病因尚不明确，但大部分学者认为与自身免疫失调、环境因素等有关[5]。儿童溃疡性结肠炎主要治疗方法包括免疫治疗、手术治疗等，但部分患儿经治疗后出现难治性、复发性溃疡性结肠炎，导致治疗失败[6]。因此，寻找溃疡性结肠炎发病机制，对于控制溃疡性结肠炎复发有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)广泛存在于血浆、血清及组织中，其可调节机体免疫炎症反应等[7]。牛磺酸上调基因1(taurine up-regulated gene 1，TUG1)具有炎症反应的作用[8]。血浆lncRNA TUG1在冠心病患者中表达上调，且与白细胞介素(interleukin，IL)6表达水平呈正相关[9]。猜测lncRNA TUG1可能在溃疡性结肠炎中也发挥作用。因此，本研究拟纳入89例溃疡性结肠炎患儿，分析lncRNA TUG1在溃疡性结肠炎患儿血清中的表达及临床意义，以期为临床上研究溃疡性结肠炎发病机制提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年10月至2020年1月本院收治的活动期溃疡性结肠炎患儿89例(研究组)，男48例，女41例，年龄6～12岁，平均(8.85±2.03)岁。病发部位：直肠11例，左侧结肠14例，广泛结肠64例。

纳入标准：(1)符合2010版《儿童炎症性肠病诊断规范共识意见》中儿童溃疡性结肠炎[10]诊断标准；(2)儿童溃疡性结肠炎疾病活动指数(Pediatric ulcerative colitis activity，PUCAI)≥10分；(3)患儿家长能全面了解、描述患儿近期饮食情况；(4)患儿家长知情同意并签署知情同意书。

排除标准：(1)合并活动性结核；(2)合并结肠穿孔、肠道细菌性感染、病毒性感染肠炎；(3)合并恶性肿瘤；(4)合并严重心、肝、肾障碍性疾病；(5)伴有自身免疫性疾病。

同期选择在本院体检的健康儿童101例为对照组，男52例，女49例，年龄6～12岁，平均(8.63±2.11)岁。研究组、对照组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院伦理委员会批准同意(SS-2018-36)。

1.2 内镜下溃疡性结肠炎严重程度评价 采用PUCAI评价病情程度[4]，轻度活动期为10～34分，中度活动期为35～64分，重度活动期为65～85分。PUCAI总分范围为0～85分，PUCAI分值越高，表示疾病活动性越强。依据PUCAI将活动期溃疡性结肠炎患者分为轻度组(10～34分)36例，中度组(35～64分)31例，重度组(65～85分)22例。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 采集健康儿童体检当天和溃疡性结肠炎儿童入院检查时清晨空腹静脉血3～4 mL，离心(4℃，3 000 r/min，25 min)，留上清，冻存于-80℃冰箱。

1.3.2 实时荧光定量PCR检测血清中lncRNA TUG1表达 用总RNA提取试剂盒(购于北京索莱宝科技有限公司)提取总血清RNA，然后用nanodrop1000微量紫外可见分光光度计(购于美国NanoDrop Tech公司)测定RNA分别在280 nm和260 nm处吸光度，并计算A260/280值，A260/280值介于1.8～2.0，表示提取的RNA可用于后续实验探究。用Qiagen逆转录试剂盒(购于德国Qiagen公司)逆转录RNA合成cDNA。用HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix(购于翌圣生物科技(上海)股份有限公司)建立25 μL荧光反应体系，引物由擎科生物科技有限公司合成，见表1。用7300实时荧光定量PCR仪(购于美国ABI公司)对lncRNA TUG1及内参β-actin进行扩增反应。反应条件：95℃，3 min；95℃，30 s；59℃，30 s；72℃，40 s；35个循环。采用2-ΔΔCt算法计算lncRNA TUG1的相对表达量。

表1qRT-PCR引物序列

1.3.3 酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)检测血清中IL-1β、IL-6水平 用ELISA法检测血清IL-1β、IL-6水平，操作步骤依据IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒(购于美国abcam公司)详细步骤说明书。

1.4 随访 所有患儿出院后，随访2年，随访方式为门诊复查或电话随访。随访内容为：记录患儿病情复发情况，分为复发组52例和未复发组37例。随访终点为患儿溃疡性结肠炎复发或随访结束。复发定义[11]：患儿经治疗进入缓解期后，随访中表现出临床症状加重，需要增加药量或改用其他药物控制，或需要外科干预治疗。

1.5 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件，计数资料用例(%)表示，采用2检验。计量资料符合正态分布，以平均值±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组比较行单因素方差分析，两组间均数进一步相比行SNK-q检验。Pearson法分析血清lncRNA TUG1与IL-1β、IL-6的相关性。用受试者工作特征(ROC)曲线评价血清lncRNA TUG1水平诊断溃疡性结肠炎的价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞因子IL-1β和IL-6的ELISA检测水平的比较 与对照组相比，研究组血清IL-1β、IL-6水平较高(P<0.05)，见表2。

表2 细胞因子IL-1β和IL-6的ELISA检测水平的比较

2.2 两组血清lncRNA TUG1 PCR检测水平比较 与对照组相比，研究组血清lncRNA TUG1相对表达水平较高(P<0.05)，见表3。

表3 两组血清lncRNA TUG1 PCR检测水平比较

2.3 亚组血清lncRNA TUG1 PCR检测水平比较 与轻度组比较，中度组、重度组血清lncRNA TUG1相对表达水平较高(P<0.05)，与中度组比较，重度组血清lncRNA TUG1相对表达水平较高(P<0.05)，见表4。

2.4 研究组血清中lncRNA TUG1 PCR水平与IL-1β、IL-6 ELISA水平相关性分析Pearson法分析显示，血清中lncRNA TUG1 PCR水平与IL-1β、IL-6 ELISA水平呈正相关(r=0.544，P=0.000；r=0.714，P=0.000)，见图1～2。

表4 亚组血清lncRNA TUG1 PCR检测水平比较

图1 血清lncRNA TUG1表达水平与IL-1β相关性分析

图2 血清lncRNA TUG1表达水平与IL-6相关性分析

2.5 血清lncRNA TUG1表达水平诊断溃疡性结肠炎的敏感度和特异度 ROC曲线显示，lncRNA TUG1诊断溃疡性结肠炎的曲线下面积(area under curve，AUC)为0.861(95%CI:0.802～0.920)，其敏感度为82.00%，特异度为89.10%。见图3。

图3 血清lncRNA TUG1表达水平诊断溃疡性结肠炎的ROC曲线

2.6 复发组和未复发组血清lncRNA TUG1表达水平比较 与未复发组比较，复发组血清lncRNA TUG1相对表达水平较高(P<0.05)，见表5。

表5 复发组和未复发组血清lncRNA TUG1表达水平比较

3 讨论

儿童溃疡性结肠炎是炎症性肠病，病变多累及结肠黏膜及黏膜下层，病理上由直肠连续扩散至结肠甚至全结肠[12]。溃疡性结肠炎发病机制已在免疫细胞活化、炎症级联反应及环境等方面展开研究，但目前仍未清楚其发病机制[13]。Chapuy等[14]研究显示，溃疡性结肠炎结肠黏膜中炎症反应依赖于IL-1β表达水平升高。张镖等[15]研究显示，IL-1β、IL-6在溃疡性结肠炎小鼠中具有重要作用，可影响病情进展。本研究显示，研究组血清IL-1β、IL-6水平明显高于对照组，提示活动期溃疡性结肠炎患儿体内存在炎症。

lncRNA已被证明是调控染色质结构的重要因子，通过与染色质、转录因子、RNA和蛋白质的相互作用发挥其功能[16]。lncRNA可通过调控NF-κB信号通路、炎症反应等生理过程而参与溃疡性结肠炎病理过程[17]。lncRNA TUG1是一种有价值的lncRNA，在多种人类疾病中发现其表达失调[18]。Tian等[19]研究显示，在溃疡性结肠炎小鼠模型中发现，TUG1过表达通过抑制 miR-29b-3p表达，促进CDK2 表达，从而促进结肠上皮细胞增殖并抑制结肠上皮细胞凋亡，最终减弱了小鼠溃疡性结肠炎的进展。本研究显示，研究组血清lncRNA TUG1相对表达水平明显高于对照组，且轻度组、中度组、重度组血清lncRNA TUG1相对表达水平依次显著升高，提示lncRNA TUG1可能参与儿童活动期溃疡性结肠炎的发生、发展。但本研究结果与Tian等[19]结果不同，可能因为人与小鼠是不同物种，TUG1表达结果不一致。李彦等[20]研究显示，脓毒症大鼠肺组织中lncRNA TUG1呈高表达，lncRNA TUG1高表达通过下调miR-26a而促进脂多糖诱导的单核巨噬细胞细胞凋亡及炎症反应。Yue等[21]研究显示，多发性硬化症小鼠小胶质细胞中，lncRNA TUG1呈高表达，并促进肿瘤坏死因子-α、IL-6水平表达增加，此过程依赖于lncRNA TUG1促进NF-κB信号通路。本研究进一步研究显示，lncRNA TUG1与IL-1β、IL-6呈正相关，提示lncRNA TUG1可能通过影响患儿体内炎症进而影响儿童病情。猜测lncRNA TUG1可能通过影响某种机制来影响患儿体内炎症反应，导致儿童活动期溃疡性结肠炎发生。Zhu等[22]研究显示，lncRNA TUG1在慢性心力衰竭患者血清中呈上调，对慢性心力衰竭具有一定的诊断价值，并且可评估慢性心力衰竭患者2年生存率。ROC曲线显示，lncRNA TUG1诊断溃疡性结肠炎的AUC为0.861，其敏感度为82.00%，特异度为89.10%，提示血清lncRNA TUG1对儿童活动期溃疡性结肠炎具有诊断价值，可为儿童活动期溃疡性结肠炎的诊断提供参考。为探究lncRNA TUG1与溃疡性结肠炎患儿预后关系，本研究发现复发组血清lncRNA TUG1相对表达水平显著高于未复发组，提示lncRNA TUG1水平变化可能对活动期溃疡性结肠炎预后也有影响。综合本研究，猜测lncRNA TUG1可能与儿童活动期溃疡性结肠炎发病机制有关，可为临床上儿童活动期溃疡性结肠炎的的诊断提供指导。

综上所述，溃疡性结肠炎患儿血清lncRNA TUG1表达水平上升，lncRNA TUG1对溃疡性结肠炎具有诊断价值，可能影响患儿体内炎症反应及预后。但本研究尚未深入探究lncRNA TUG1影响儿童活动期溃疡性结肠炎的机制，后续仍需探究。

利益相关声明：所有作者均声明不存在任何利益冲突。

作者贡献说明：王璐、彭韶：负责提出研究选题、设计研究方案、实施研究过程、采集整理和分析数据；王璐、张媛、罗静：负责调研整理文献、设计论文框架、起草论文、修订论文、终审论文；王璐、盛光耀：负责获取研究经费、技术或材料支持和指导性支持。