缝隙连接蛋白43促进胃癌肝转移的机制*

段江曼, 刘宁, 周欢欢, 汤跃强, 付晓红, 孙杰, 周启明△

华中科技大学协和深圳医院 1肿瘤内科, 2血液内科(广东深圳 518052)

胃癌的发病率和病死率均列于所有恶性肿瘤的前3位，5年生存率不足10%。侵袭转移是胃癌患者预后不良的重要原因[1-2]。胃癌常见的转移途径是血行转移、腹膜种植转移和淋巴转移，其中肝脏是胃癌血行转移的好发部位，3.5%～14.0%的胃癌患者可发生肝转移[3]。当发生远处转移时，多失去手术指征而采用化疗及靶向药物等姑息性治疗，且预后非常差，中位生存期为3～13个月[4]。目前胃癌远处转移的机制尚未完全阐明，因此研究胃癌远处转移的相关分子机制，对其进行早期防控与治疗，提高患者生存率具有重要的意义。缝隙连接蛋白43(connexin 43, Cx43)可介导细胞间通讯参与肿瘤微环境改造。有研究证据显示，Cx43具有与肿瘤抑制因子类似的功能[5-6]，修复Cx43可以抑制癌细胞生长[7]。更多的文献检索发现，Cx43可促进肿瘤转移。以Cx43建立的癌细胞-星形胶质细胞的缝隙连接显著促进了脑转移[8]。Cx43介导的缝隙连接有助于胃癌细胞的腹膜浸润[9]。Cx43可与巨噬细胞[10]、成纤维细胞[11]、内皮细胞[12]、间皮细胞[9]等发生缝隙连接，参与肿瘤细胞对自身微环境的改造和定植生长。同时，肝巨噬细胞(Kupffer细胞)可极化为M2型巨噬细胞，肿瘤的低氧微环境可诱导M2型巨噬细胞高表达多种促血管生成因子和细胞因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素-10(IL-10)等[13]，从而对肿瘤微环境进行改造，加速肿瘤的进展。研究表明cAMP可促进细胞IL-10的表达，而在细胞通讯过程中，缝隙连接通道常常传输cAMP来进行细胞间的交互作用[14]。然而，对于胃癌肝转移过程中胃癌细胞如何调控其肿瘤微环境知之甚少。因此，本研究旨在探讨Cx43在胃癌中的表达、预后及在胃癌肝转移过程中如何参与肿瘤微环境改造。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究纳入胃癌的140例患者的组织切片进行分析，同时收取5例新鲜胃癌组织及对应肝转移瘤组织，所有临床样本均按照离体 40 min 内经液氮速冻后保存于液氮罐的标准进行保存。所有样本在收集前通过本单位伦理委员会批准及患者知情同意，符合指南规定。纳入收入的标本已临床病理诊断确诊为胃癌。

1.2 免疫组化实验 将收集的胃癌石蜡标本进行切片、常规脱蜡、水化等处理，过氧化物酶阻断及非免疫血清孵育后，依次加入Anti-Cx43一抗及生物素标记的二抗孵育，DAB显色。

使用半定量方法对肿瘤组织中的Cx43表达水平进行评分。免疫染色强度评分如下：0(阴性)、1(弱)、2(中等)和3(强)。根据面积百分比量化免疫染色的程度：0(无阳性染色)、1(<10%)、2(10%～50%)或3(>50%)。范围和强度分数的总和是最终的染色分数(0～6)。分数≤3被认为低表达，而分数≥4被认为是高表达。

1.3 荧光定量RT-PCR Trizol 裂解液提取细胞总 RNA，测定 RNA 浓度及纯度，按照逆转录试剂盒说明书操作，将 RNA 逆转为 cDNA，采用 SYBR® Green 染料法进行荧光定量 PCR 实验，GAPDH作为内参。采Primer5.0设计各待测基因的上、下游引物，引物由 Invitrogen 公司合成。

1.4 Western blot 细胞溶解液抽提组织蛋白，BCA 法测定蛋白含量。进行 SDS-PAGE 电泳，转膜，封闭，用一抗、内参抗体 4℃封闭过夜, 再用含辣根过氧化酶二抗室温孵育 1 h，洗膜后，ECL 化学发光后，观察蛋白的变化，进行半定量分析。

1.5 MTT实验 将胃癌细胞-肝巨噬细胞共培养后的条件培养基，对胃癌细胞刺激18 h左右，将其制成单细胞悬液，接种至 96孔培养板中(500～1 000个细胞/孔)，0～5 d各加入MTT液(2 mg/mL)20 μL/孔，每次5个复孔，继续培养4 h，吸出培养液，加入DMSO(150 μL/孔)，使结晶物融解。用酶标仪测定OD 570 nm，绘制细胞活力曲线图。

1.6 细胞凋亡 采用Annexin V/PI双标记法检测细胞凋亡。消化并收集细胞，PBS洗2次，重悬于结合液中，吹打成单细胞悬液。取细胞悬液与Annexin V-FITC及PI于室温下黑暗处孵育15 min，利用流式细胞仪(FACScalibur，BD公司)检测， CellQuest分析软件分析结果。

1.7 统计学方法 采用GraphPad Prism 8(GraphPad Software)进行数据统计分析。应用Kaplan-Meier方法检验Cx43的表达与患者生存时间的关系。MTT实验采用重复测量的方差分析，余PCR、Western blot等实验结果采用Student′s-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cx43在胃癌组织中的表达 Timer2.0数据库中显示27种肿瘤中存在Cx43突变，其中胃癌中Cx43突变概率位列第三(图1-A)。胃癌组织中Cx43(GJA1)的mRNA的表达低于癌旁组织(图1-B)。通过免疫组化进行临床验证我们得到了一致性结果，胃癌患者癌组织中的Cx43蛋白表达低于癌旁组织(图1-C)。此外，根据免疫组化评分，纳入研究的140例胃癌患者组织中62例患者 Cx43 的表达为阳性，阳性率为44.29%；癌旁胃正常组织则有128例 Cx43 表达为阳性，阳性率为 91.43%，两者 Cx43 表达差异有统计学意义(P<0.01)。

注：A：Timer2.0数据库中不同癌种Cx43的突变频率； B：Timer2.0数据库中不同癌种Cx43基因在癌组织及癌旁组织的表达； C：140例胃癌患者Cx43在癌组织及癌旁组织的蛋白表达

2.2 胃癌患者Cx43的表达与临床病理特征的相关性 140例胃癌患者，随访时间为0.5～3年(2018—2021年)，通过胃癌组织中Cx43蛋白表达与临床指标(性别、年龄、TNM分期、临床分期，分化程度)进行检验分析，结果显示Cx43蛋白在胃癌组织的表达水平与胃癌患者的临床分期，浸润深度，淋巴结转移及分化程度有关，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 胃癌患者Cx43的表达与临床病理特征的关系 例(%)

2.3 Cx43表达与胃癌患者预后的关系 利用oncolnc数据库(图2-A)、kmplot数据库(图2-B)及TCGA数据库(图2-C)中胃癌患者数据进行Kaplan-Meier生存分析，均发现Cx43(GJA1)表达越高，胃癌患者的生存率越低。我们对纳入的140例胃癌患者进行Kaplan-Meier存活曲线分析，发现Cx43表达越高，胃癌患者的预后越差(图2-D)，差异均具有统计学意义。

注：A：oncolnc数据库中胃癌患者Cx43的表达与预后的关系； B：kmplot数据库中胃癌患者Cx43的表达与预后的关系； C：TCGA数据库中胃癌患者Cx43的表达与预后的关系； D：纳入的140例胃癌患者Cx43的表达与预后的关系

2.4 Cx43在胃癌肝转移灶中的表达 针对TCGA数据库中胃癌患者的Cx43 mRNA表达水平结果分析提示，未发生转移的胃癌患者癌组织中Cx43表达低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)，加入发生肝转移的患者数据后，该差异消失(图3-A、B)。对5例胃癌肝转移标本中胃癌组织、癌旁组织及肝转移组织分别进行Cx43蛋白水平检测，发现Cx43胃癌原发灶中表达最低，癌周正常组织其次，肝转移灶中表达最高(P<0.01，图3-C)。

注：A：TCGA数据裤中无肝转移的胃癌患者癌组织与癌旁组织Cx43的基因表达； B：TCGA数据库中包含肝转移的胃癌患者癌组织与癌旁组织Cx43的基因表达； C：胃癌患者新鲜组织Cx43的蛋白表达。*为P<0.05，Tumor：胃癌组织；Non-Tumor：癌旁组织，HM：肝转移组织

2.5 Cx43介导的癌细胞-肝巨噬细胞缝隙连接促进胃癌肝转移 检测永生化上皮细胞GES-1与5株胃癌细胞(MNK-45、SGC-7901、MGC-803、BGC-823、AGS)中Cx43的表达情况发现，Cx43在胃癌细胞中表达均低于GES-1，5株胃癌细胞中MGC-803细胞Cx43低表达，BGC-823细胞相对Cx43高表达。将肝巨噬细胞(Kupffer细胞)和胃癌细胞MGC-803/BGC-823共培养后，收集其条件培养基，重新对胃癌细胞进行刺激，检测Cx43 mRNA的表达，发现较对照组明显增高，见表2。

表2 Cx43在不同培养基刺激胃癌细胞后的基因水平表达

通过MTT实验测定肿瘤细胞活力，提示胃癌细胞与Kupffer细胞共培养的条件培养基刺激后可以明显促进肿瘤细胞MGC-803/BGC-823的增殖率，有统计学意义(P<0.05),见表3～4。

表3 条件培养基刺激MGC803胃癌细胞的活力测定

表4 条件培养基刺激BGC823胃癌细胞的活力测定

加入胃癌常用化疗药物奥沙利铂后，发现奥沙利铂对条件培养基刺激的肿瘤细胞MGC-803/BGC-823凋亡作用明显下降(P<0.001,图4)。

注： ***为P<0.001

2.6 Cx43促进胃癌肝转移过程可能参与的信号通路 我们利用荧光RT-PCR检测与癌细胞共培养18 h后Kupffer细胞中不同细胞因子或促血管生成因子的表达，例如TGF-β、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、VEGF mRNA的表达水平，发现IL-10的mRNA表达明显增加(图5)。

图5Kupffer细胞中多种因子的表达

将胃癌细胞利用cAMP抑制剂SQ22536处理18 h后与肝巨噬细胞共培养，检测IL-10的表达情况，与对照组相比，加入cAMP抑制剂的胃癌细胞中 IL-10表达下降(表5)。

表5 IL-10在加入cAMP抑制剂后的基因表达水平

此外，利用瞬时转染沉默Cx43的胃癌细胞MGC-803与Kupffer细胞共培养后检测Kupffer细胞中中IL-10的表达，发现条件培养基刺激后，沉默组的IL-10表达明显下降(表6)。

表6 不同条件培养基刺激后IL-10的基因表达水平

利用Western blot检测Cx43沉默组与对照组癌细胞中p-STAT3、STAT3的表达改变情况。当无条件培养基刺激时，STAT3信号通路激活不明显；条件培养基刺激后，沉默Cx43组(sh1、sh2)，p-STAT3、CyclinD1均较对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05，图6)。

图6 不同条件培养基刺激后STAT3、CyclinD1的蛋白表达

3 讨论

肿瘤侵袭转移是一个多步骤的细胞生物学过程。不少研究提示缝隙连接与肿瘤侵袭转移具有密切关系[15]。Cx43是目前已知在人体内分布广泛，与肿瘤关系最为密切的缝隙连接蛋白。在不同癌种中均有表达[16-17]，也有研究通过电镜观察到胃癌组织中 CX43 介导的缝隙连接遭到破坏，且破坏程度与恶性程度呈正相关，由此推断 CX43 介导的缝隙连接功能降低可能是促癌变阶段的重要机制[18]。通过TCGA数据库发现胃癌原发灶中Cx43表达低于癌旁组织，免疫组化得到验证。我们的研究发现Cx43表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期及分化程度有关，分期越晚，Cx43的表达越高，总生存期越短，说明Cx43表达参与了胃癌的发生发展。有研究指出 Cx43 在原发性骨肿瘤中作为肿瘤抑制因子的同时也可作为肿瘤促进因子在肿瘤的发展中起着拮抗作用[19]。TCGA数据库中胃癌患者的Cx43 mRNA表达水平结果显示，与正常组相比，未发生转移的胃癌患者中Cx43表达下降，加入发生肝转移的患者数据后，该差异消失。Cx43参与了胃癌肝转移过程，然而具体作用机制尚不可知。

在肿瘤微环境中，巨噬细胞与肿瘤细胞有着相互作用的关系。浸润在肿瘤中的巨噬细胞称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages, TAMs)，在肿瘤免疫逃逸阶段，肿瘤微环境的改变会使TAMs向M2型巨噬细胞分化[13]，M2型巨噬细胞通过抑制免疫反应，促进肿瘤血管和淋巴管形成和侵袭等多种途径使肿瘤生长和转移[20]。有研究提示，M2型巨噬细胞参与胃癌腹膜转移[13]和肝细胞癌进展[21]。常驻肝脏中的巨噬细胞是Kupffer细胞，也是人体内最大的组织巨噬细胞。我们研究发现胃癌细胞能与肝巨噬细胞形成由Cx43介导的缝隙连接，促进胃癌细胞在有肝巨噬细胞的肿瘤微环境中增殖。M2型巨噬细胞可分泌IL-10、TNF-β等细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶(MMP)等，参与免疫抑制、组织重塑与修复及血管生成[22]。通过检测与癌细胞共培养后肝巨噬细胞中多种细胞因子的表达水平，发现IL-10表达明显高于其他细胞因子，但IL-10的表达与条件培养基的不同是否有相关性，有待进一步验证。

在细胞通讯过程中，缝隙连接通道常常传输cAMP来进行细胞间的交互作用。cAMP在真核生物中的主要功能是激活PKA。PKA在其转录激活位点丝氨酸133处促进cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化[23]。一旦被磷酸化，CREB参与多种细胞过程，包括细胞增殖、存活、分化等[24]。已有研究显示CREB诱导具有CRE元件的免疫相关基因的转录，包括IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、环氧合酶-2和巨噬细胞迁移抑制因子[23]。有研究发现与M2巨噬细胞共培养可显著刺激癌细胞中的STAT3通路激活，导致癌细胞增殖和进展[25]。STAT3是信号转导及转录激活(signal transducer and activator of transcription, STAT)家族一员，与细胞的异常增殖密切相关。激活的STAT3与细胞周期蛋白D1(cyclin D1)升高相关[26]，并且在胃癌中STAT3和cyclin D1过表达激活参与了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[27]。我们研究发现cAMP与IL-10的表达具有一致性，p-STAT3及CyclinD1与Cx43的表达一致，综上，我们发现Cx43介导缝隙连接使胃癌细胞与肝巨噬细胞形成交互作用，促进胃癌细胞在肝脏中增殖，而cAMP、IL-10、STAT3及CyclinD1等分子参与了这一肿瘤微环境的改变。但是目前结果不足以说明cAMP促进巨噬细胞分泌IL-10，继而激活下游STAT3信号通路来促进增殖。

我们首次报道了Cx43在胃癌肝转移过程中发挥的作用，癌细胞通过由Cx43介导的缝隙连接与肝巨噬细胞形成交互作用，通过该缝隙连接传输cAMP至肝巨噬细胞，促进肝巨噬细胞旁分泌IL-10，并探索了可能参与的信号通路，但这些结果仍需要一系列实验进行验证及深入挖掘。以上结果发现，对胃癌肝转移的研究提供了新思路，深入研究可能对胃癌肝转移的发生发展提供新的靶点。

利益相关声明：所有作者均声明论文内容不存在利益冲突。

作者贡献说明：实验设计及论文撰写为段江曼，临床资料收集与统计为刘宁，周欢欢、汤跃强、付晓红进行实验实施，评估与指导为孙杰，周启明审校。