宫颈癌癌组织中差异表达蛋白的蛋白组学研究*

海静, 李文娟, 王文翔, 杨静, 董学彩

1新乡市中心医院妇产科(河南新乡 453000)； 2辽宁省人民医院妇产科(辽宁沈阳 110016)

宫颈癌是女性生殖系统较为常见的恶性肿瘤之一，好发于中老年女性，国内每年新发病患约13万例，死亡约5万例，宫颈癌患者死亡例数占女性全部恶性肿瘤死亡例数的18.4%左右[1]。研究证实[2-3]，宫颈癌发病机制复杂，涉及遗传、免疫炎症、肠道菌群等多种因素，具体发病机制不清。蛋白属于基因表达的产物，也是机体生理功能的最终执行者，蛋白质组学是指该物种所表达的全套蛋白质，通过蛋白组学进行系统分析能更好的探讨复杂疾病的发病机制[4]。本研究通过TMT标记的蛋白组学技术探讨宫颈癌患者癌组织中的差异表达蛋白，并进行生物信息学分析和验证，以期为宫颈癌的发病机制和靶向治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 共纳入12例于2020年10月至2021年3月于新乡市中心医院就诊的宫颈癌患者作为研究对象。

纳入标准：(1)患者入院后通过术后组织病理学确诊；(2)首次于我院诊断，既往未经过任何治疗，且年龄超过18周岁；(3)均进行知情同意且自愿加入研究。

排除标准：(1)转移性宫颈癌患者；(2)存在严重肝肾功能不全、血液系统疾病及急慢性感染性疾病患者；(3)临床资料不完整的患者。

另选取我科室同期12例进行宫颈活检的患者作为阴性对照，需满足宫颈活检后显示宫颈无任何病变，排除合并肝肾功能不全、感染性疾病、自身免疫性疾病等患者。本研究中将24例研究对象分为实验组和验证组，其中10例宫颈癌患者和10例宫颈活检正常者构成实验组，其余2例宫颈癌患者和2例宫颈活检正常者构成验证组。所有研究对象均知情同意且签署知情同意协议书。该研究经新乡市中心医院科研和临床伦理委员会伦理审查通过(YXLL2019-0107)。

1.2 TMT标记的蛋白组学

1.2.1 样品准备、蛋白提取、胰酶溶解、TMT标记 样品准备：通过手术及活检获得宫颈癌组织和正常宫颈组织，术后立即采用0.9%生理盐水冲洗血渍后置于-80℃冰箱中保存。蛋白提取：加入液氮后研磨成粉末，之后加入PBS超声下裂解，再加入等体积的TRIS平衡酚(sigma，美国)离心10 min，离心机转速5 500 r/min，离心半径r=5 cm。移液管吸取上清液后置入新的EP管中，加入5倍体积的0.1 mol/L乙酸铵(国药集团，中国)、甲醇(ThermoFisher Scientific，美国)进行沉淀，用甲醇和丙酮(杭州汉诺化工，中国)各洗涤沉淀1次，最后用8 mol/L尿素(Sigma，美国)复溶沉淀。胰酶溶解：加等量标准蛋白于等体积的各组样品中，加入RIPA细胞裂解液(武汉卡诺斯科技有限公司，中国)和二硫苏糖醇(Sigma，美国)，调整其终浓度为5 mmol/L，于56℃保温箱中还原30 min，加入碘乙酰胺(Sigma，美国)调整其终浓度为11 mmol/L，避光孵育15 min，再次加入TEBA(济南世纪通达化工有限公司，中国)稀释使得浓度低于2 mol/L。以1∶50比例加入胰蛋白酶进行胰酶溶解并过夜(ThermoFisher Scientific，美国)。TMT标记：各组的胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex，美国)除盐后真空冷冻干燥，0.5 mol/L TEAB溶解肽段，TMT试剂盒标记肽段，具体操作参考TMT试剂盒说明书进行。

1.2.2 液相色谱-质谱联用分析 肽段用液相色谱流动相A相(含有0.1%甲酸和2%乙腈)溶解，继续使用EASY-nLC 1000超高效液相系统流动相B(含有0.1%甲酸和90%乙腈)进行分离，流速600.00 nL/min。流动相B梯度设置：0～38 min，8%～23%B；38～52 min，23%～35%B；52～56 min，35%～80%B；56～60 min，80%B。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进QE plus质谱进行分析。

1.2.3 数据库查询采用PD 2.4软件进行二级质谱数据分析，数据库为Homo_sapiens_9606(含有20380条序列)。差异蛋白需满足adjustP值<0.05且logFC>2或logFC<-2，当adjustP值<0.05且logFC>2时为显著上调，当adjustP值<0.01且logFC<-2时为显著下调，

1.3 生物信息学分析 GO富集分析和KEGG通路分析通过DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)在线进行，蛋白与蛋白互作(protein protein interaction，PPI)分析通过STRING在线进行(https://cn.string-db.org/)。GO富集分析包括细胞组成(CC)、分子功能(MF)和生物进程(BP)；KEGG通路分析为将所得到的具有显著差异的蛋白进行通路富集分析；通过PPI分析构建差异蛋白互作网络。GO富集分析和KEGG通路分析均以P<0.05为差异具有显著性，PPI分析中将互作评分>0.900作为阈值。

1.4 Western blot验证 分别取宫颈癌癌组织和正常宫颈组织置于消毒后的研钵中，加入液氮研磨后移入新的EP管，再次加入RIPA裂解液500 μL， 冰上孵育30 min后离心，离心机转速8 000 r/min，离心半径r=5 cm，提取上清液后置入-80℃冰箱中。取5 μL蛋白样品进行电泳、电转、牛奶封闭，加入一抗IKKβ(1∶300，万类生物科技有限公司，中国)、CDK2(1∶500，Abcam公司，美国)、COX4(1∶200，上海雅吉生物科技有限公司，中国)、AKT(1∶500，万类生物科技有限公司，美国)、Ras(1∶100，Abcam公司，美国)和β-actin(1∶1 000，万类生物科技有限公司，中国)并4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗(1∶1 000)孵育1 h。组织中目标蛋白相对表达水平=目标蛋白的灰度值/β-actin灰度值，重复测量3次，取平均值。每个条带的蛋白灰度值采用Image J软件检测。

1.5 统计学方法 应用GraphPad Prism 5 软件进行数据分析，数据用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的基本资料 实验组和验证组患者的基本信息如下，实验组和验证组两组基线资料年龄、体质指数(BMI)比较差异无统计学意义(P>0.05)，实验组和验证组中宫颈癌患者组织类型均为鳞癌，TNM分期均为Ⅱ期。见表1。

表1 研究对象的基本资料分析

2.2 宫颈癌癌组织中的差异表达蛋白 共有4 718个蛋白被定量分析，结果见图1。相对于正常宫颈组织而言，宫颈癌癌组织中发生显著改变的蛋白共有353个，其中上调的蛋白有190个，发生显著下调的蛋白有163个。见图1、2。

图1 蛋白组学中鉴定到的蛋白基本信息

2.3 GO富集分析和KEGG富集分析 对发生显著改变的353个蛋白进行GO富集分析和KEGG富集分析，结果显示，在GO富集分析中，涉及的生物学过程主要为中性粒细胞活化、氧化应激、免疫应答及急性相反应等为主；对差异蛋白进行KEGG富集分析后发现，差异蛋白主要涉及到IL-17信号通路、人乳头瘤病毒感染相关通路、PI3K-AKT信号通路、氧化磷酸化、MAPK信号通路等。见图3、4。

2.4 PPI分析 对宫颈癌癌组织中显著上调或下调的差异蛋白进行PPI分析，将互作评分>0.900作为阈值后共筛选出109个差异蛋白，提示这些蛋白可能是宫颈癌的致病蛋白，见图5。将109个差异蛋白分别再次进行GO和KEGG富集分析，结果显示，109个蛋白进行GO和KEGG富集分析后的结果基本和所有差异蛋白的富集结果基本相一致，主要涉及到免疫炎症、氧化应激、IL-17信号通路等有关，见图6、7。按照PPI蛋白交互作用的相关度排序，我们进一步分析PPI分析中相关度最为显著的前5种蛋白，蛋白相关信息见表2。

2.5 Western blot验证 我们在验证组中对上述5种蛋白在宫颈癌癌组织中的表达进行Western blot独立验证，结果显示，宫颈癌癌组织中IKKβ、CDK2、COX4、p-AKT和Ras蛋白表达水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图8。

图2 宫颈癌癌组织中的差异表达蛋白

图3 453种差异表达蛋白的GO富集分析

3 讨论

宫颈癌发病机制复杂，目前大多数研究认为，免疫炎症，尤其是多种信号通路和炎症介质在宫颈癌中的发病机制中扮演了重要作用[2-3，5]。近年来蛋白组学在生物医学领域应用广泛，通过蛋白组学能够很好的探讨复杂疾病的致病蛋白、预测药物疗效及发病机制研究。TMT(tandem mass tag)是一种是定量蛋白质组学中经典的高通量筛选技术[6]，然而，目前国内尚无通过TMT标记的蛋白组学技术探讨宫颈癌癌组织中的致病蛋白。

本研究结果发现，在宫颈癌癌组织中发生显著上调的蛋白有190个，发生显著下调的蛋白有163个，经过GO和KEGG富集分析后显示，这些差异蛋白涉及到多种生物学过程和多种信号通路，这也间接证实宫颈癌发病机制的复杂性。GO富集分析中生物学过程中最为显著的是中性粒细胞活化，KEGG富集分析中最为显著的是IL-17信号通路，IL-17属于一种促炎因子，这提示宫颈癌的发生发展可能主要与免疫炎症有关，研究证实中性粒细胞促肿瘤作用主要与肿瘤血管形成有关[7]，而血运转移也是宫颈癌常见的转移方式之一，N2型中性粒细胞可分泌IL-18等趋化因子，通过与肿瘤细胞表面的CXCR2结合而参与肿瘤血管的形成[8]，也可直接分泌VEGF和MMP-9刺激肿瘤血管的形成，并促进肿瘤的局部转移和侵袭[9]。通过PPI分析后进一步筛选出了109种和宫颈癌发病机制密切相关的蛋白，GO和KEGG富集分析也证实这些蛋白涉及的生物学过程及信号通路和所有差异蛋白的富集分析结果类似，提示这些蛋白在一定程度上可代表整体差异蛋白，其中前5种相关度最高的蛋白如IKKβ、CDK2、COX4、AKT和Ras可涉及与肿瘤发生发展的多种生物学过程及信号通路。

图4 453种差异表达蛋白的KEGG通路分析

图5 109种差异蛋白的PPI分析

图6 109种差异蛋白的GO富集分析

图7 109种差异蛋白的KEGG通路分析

表2 5种核心蛋白的基本信息

图8 Western Blot验证

我们再次对这5种差异蛋白进行独立样本验证，结果显示IKKβ、CDK2、COX4、p-AKT和Ras在宫颈癌癌组织中的表达水平显著升高，与蛋白组学结果基本一致，这也进一步证实这5种蛋白可能促进了宫颈癌的发生发展。IKKβ在促进肿瘤生长过程中作用显著，研究显示[10]，IKKβ能有效逆转阿司匹林对人前列腺癌细胞的抗增殖及侵袭作用，当使用IKKβ抑制剂后能显著减轻这种效应。Li等[11]证实苯乳酸促进宫颈癌细胞的增殖与迁移主要与其活化IKKβ后进而诱导NF-κB的激活及MMP-9表达上调有关，此外，PI3K-AKT-IKKβ信号通路也在宫颈癌发病机制中扮演了重要作用[12]。CDK2属于细胞周期依赖性激酶(cyclin-dependent kinases)的家族成员之一，除调控细胞周期外，还能调控多种信号通路而促进肿瘤的发生，CDK2在多种肿瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌等中高表达[13]，Gao等[14]发现宫颈癌患者化疗后癌组织中CDK2蛋白和CDK2 mRNA表达水平得到显著降低；刘冰洁等[15]发现CDK2表达上调可抑制宫颈癌细胞凋亡，促进癌细胞的增殖、侵袭和转移等，CDK2涉及的信号通路为p21/Cyclin E/CDK2，主要受NF-κB调控，张哲等[16]证实NF-κB调控p21/Cyclin E/CDK2信号通路从而促进宫颈癌细胞的增殖。Akt和PI3K/AKT信号通路在调节细胞凋亡和增殖过程中发挥显著的作用，抑制AKT活化后能有效抑制宫颈癌细胞的增殖并促进凋亡[17]。COX4主要影响线粒体功能，参与氧化磷酸化生理过程，目前关于COX4和宫颈癌的相关性研究报道较少，但其他研究结果证实C0X4可能参与了肿瘤的发生发展，Bikas等[18]发现甲状腺癌组织中COX4高表达，与淋巴结转移密切相关，主要与p70S6K/pS6 和p-ERK信号通路有关，而蛋白质组学也鉴定出COX4属于乳腺癌的一项标志物[19]。Ras属于致癌基因已经得到共识，Ras及其下游的蛋白参与多种复杂的信号通路，但与COX类似，Ras如何参与宫颈癌的发病机制研究报道较少，一项宫颈癌小鼠模型结果显示[20]，小鼠血清及血液外泌体中Ras蛋白表达水平显著升高，此外，化疗药物对宫颈癌细胞的杀伤作用也主要是通过抑制Ras及其下游的信号通路[21]。

综上所述，本研究采用TMT标记的蛋白组学技术对宫颈癌癌组织和正常宫颈组织中的蛋白进行分析，筛选出差异蛋白并进行生物信息学分析，初步探讨了宫颈癌的复杂发病机制及治疗靶点，为下一步研究提供了新思路；然而本研究的不足之处在于样本量较少，日后仍需要大样本量的研究结果来验证我们的结论。

利益相关声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献说明：海静是本研究的实验构思和设计者，负责分析蛋白组学数据及撰写论文；王文翔是实验标本收集者；杨静和董学彩进行蛋白验证实验操作；李文娟提供部分蛋白组学研究经费。全体作者均阅读并同意最终的文本。