三阴乳腺癌中MYC和CSMD1基因拷贝数变异与临床病理特征的相关性*

王智辉,李荣岗,钟媚共,伍婉婷,孟子杰,郑焱,张鑫△

江门市中心医院 1肿瘤科，2病理科，4医学研究中心(广东江门 529030)；3江门市妇幼保健院药学部(广东江门 529000)；5广东省人乳头状瘤病毒(HPV)相关疾病分子诊断工程技术研究开发中心(广东潮州 521021)

乳腺癌是最为常见的女性特发恶性肿瘤，临床上以乳腺浸润性导管癌(breast infiltrating ductal carcinoma,BIDC)为主要病理类型。在全球及我国女性中，乳腺癌发病率一直占据着首位，且40年来呈上升趋势，严重威胁着全球女性的生命健康[1-2]。令人欣慰的是，近30年来，乳腺癌患者的病死率持续下降，这主要得益于化疗药物、内分泌治疗药物及靶向药物的规范化综合应用[1]，但是三阴乳腺癌(triple negative breast carcinoma,TNBC)，作为其中一种特殊的病理分子亚型，具有较高的恶性生物学特征，且无法使用内分泌治疗药物并缺少常见的靶向药物，5内年发生术后进展的概率明显高于其他基因亚型[3-4]，是乳腺癌临床治疗中的难点。临床诊治中[5]，将雌激素受体(estrogen receptor,ER)和孕激素受体(progesterone receptor,PR)免疫组化检测阴性，人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)免疫组化阴性或其编码基因ERBB2 (erb-B2 receptor tyrosine kinase 2)无扩增的浸润性乳腺癌归为TNBC。有研究指出[3-5]，TNBC约占所有乳腺癌的15%，而我国TNBC的发病比例可能更高。因为缺少真正意义的辅助诊断指标，所以TNBC目前多作为排除性的分类；而关于TNBC全基因组拷贝(copy number variations,CNV)分析的研究较少，依然未见明确具有TNBC辅助诊断意义的CNV的报道。因此，本课题组将尝试利用全基因组CNV分析的方法，在癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA,https://gdc-portal.nci.nih.gov/)中尝试挖掘出TNBC相关的基因。

1 资料与方法

1.1 TCGA TNBC的全基因组拷贝数变异分析 参考本课题组已发表文献[6]，下载TCGA中乳腺癌的基因组拷贝信息(由Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片过滤得到)及对应样品的临床信息，数据库的更新下载日期为2020年1月31日，共1 099例。利用临床信息中ER、PR和HER2的免疫组化染色结果及ERBB2 DNA原位杂交结果，筛选出ER和PR免疫组化为阴性，同时HER2免疫组化阴性或ERBB2非扩增的TNBC 153例，占比约13.9%。在GenePattern公共服务器平台(https://genepattern.broadinstitute.org/)上，利用GISTIC 2.0软件分析肿瘤组织的全基因组拷贝信息，其中原始拷贝数信息源自TCGA数据库下载整理，参考基因组为人类19版基因组(human genome 19,hg19)，探针标记的物理位点信息(Markers file)和CNV参照信息(CNV file)均整理自SNP Array 6.0的第35版本信息(http://www.affymetrix.com/)；关键的运行参数均为默认，并分析X染色体的拷贝数变异情况。运行所得的关键数据有：(1)每个探针标记位点的扩增或缺失情况，即G评分(G-score)；G评分的高低能综合反映该位点的扩增或缺失的深度和频率。(2)每个样品中单个基因的拷贝数变异情况，包括缺失(deletion)、二倍体(diploid)和扩增(gain)3个状况。

1.2 拷贝数变异热点区域的关键基因分析 参考本课题组已发表文献[7]，利用IGV软件导入GISTIC 2.0分析所得的G评分结果，其中用红色的线条代表扩增G-value的数值高低，用蓝色的线条代表缺失G-value的数值高低。通过峰型定位拷贝数变异的染色体区段，勾画出热点区域中心位置的关键基因。最后导出所得图像，并在Canvas 14.0软件中绘制矢量图。

1.3 患者一般信息 收集整理2017年1月至2019年12月在江门市中心医院就诊的并手术的BIDC患者信息和标本，排除无法取得足够治疗前样品的接收新辅助治疗的病例，共剩961例，根据ER、PR和HER2的免疫组化染色结果及ERBB2 DNA原位杂交结果，筛选出ER和PR免疫组化为阴性，同时HER2免疫组化阴性或HER2免疫组化2+及以下且ERBB2非扩增的TNBC 108例，占比约11.2%。TCGA与江门市中心医院TNBC患者的一般信息见表1，两群样品在性别、年龄、病理类型及TNM临床病理分期的分布差异均无统计学意义(P<0.05)。

表1 TCGA及江门市中心医院TNBC患者的基本信息 例(%)

1.4 qPCR检测石蜡标本的禽骨髓细胞瘤病病毒致癌基因同源物(avian myelocytomatosis viral oncogene homolog,MYC)基因和CUB和Sushi多结构域基因1(CUB and sushi multiple domains 1,CSMD1)基因拷贝数变异 参考本课题组已发表文献[6]，调取患者手术标本中肿瘤成分70%的石蜡组织，10 μm厚度切片4张。利用GeneRead DNA FFPE Kit按操作说明书提取石蜡切片的DNA；利用TaqMan Copy Number Assay的荧光定量PCR引物Hs00292858_cn检测MYC基因拷贝数，引物Hs03655295_cn检测CSMD1基因拷贝数，其中内参引物为TaqMan Copy Number Reference Assay RNase P，二倍体参考样品为健康人血浆白膜层样品，扩增试剂盒为TaqMan Fast Advanced Master Mix，按说明书在CFX96荧光定量PCR仪中检测。规定样品中目标基因的相对拷贝数检测值<0.75为缺失，>1.5为扩增，其余为二倍体。

1.5 统计学方法 计数资料用频数表示，用Excel 2016及GraphPad Prism 7.0软件处理数据，各组间频数数据统计使用2检验(Chi-squared test)或Fisher′s精确检验(Fisher′s exact test)，检验水平α=0.05。

2 结果

2.1 TCGA TNBC全基因组拷贝数分析 通过GISTIC 2.0软件分析，能得到TCGA数据库中TNBC肿瘤组织的全基因组拷贝数变异情况，见图1，8q24.21、1q21.3和19q12是扩增最为显著的3个区段(图1-A)，8p23.2、10q23.31和13q14.2是缺失最为显著的3个区段(图1-B)。其中，我们在扩增区段和缺失区段分别选择了G评分最高及q值最小的8q24.21和8p23.2作为研究重点。

注：A:扩增最显著的3个区段；B:缺失最显著的3个区段图1 TCGA TNBC的全基因组拷贝数分析

2.2 8q24.21区段的关键基因 通过IGV软件观察8q24.21区段的信息，可以明确TNBC的扩增峰在MYC基因处(图2-A)，利用GISTIC2.0软件的自动阈值计算结果，得到TCGA的153例TNBC肿瘤组织中，MYC基因发生缺失3例(2.0%)，正常二倍体23例(15.0%)，余下127例(83.0%)为扩增。

2.3 8p23.2区段的关键基因 通过IGV软件观察8p23.2区段的信息，可以明确TNBC在8p23.2区段无显著缺失峰，而此区段最主要的为含CSMD1基因(图2-B)，利用GISTIC2.0软件的自动阈值计算结果，得到TCGA的153例TNBC肿瘤组织中，CSMD1基因发生扩增31例(21.7%)，正常二倍体26例(18.2%)，余下96例(67.1%)为缺失。

注：A:8q24.21区段；B:8p23.2区段图2 8q24.21及8p23.2区段的拷贝数变异热点区域基因

2.4 TCGA TNBC中MYC扩增及CSMD1缺失与患者临床病理特征的关系 将TCGA中TNBC患者的临床信息与MYC的扩增及CSMD1的缺失情况进行统计分析，仅发现CSMD1的缺失与较低的T分级相关(P<0.05)，与年龄、病理类型、N分级、M分级及临床病理分期无关(P>0.05)；而MYC的扩增与上述临床病理特征均无关(P>0.05)。见表2。

表2 TCGA TNBC中MYC扩增及CSMD1缺失与患者临床病理特征的关系 例

2.5 江门市中心医院TNBC组织中MYC和CSMD1基因拷贝数的检测 利用qPCR检测我院108例TNBC肿瘤组织的MYC和CSMD1基因拷贝数，结果显示，MYC基因无缺失情况，二倍体有12例(11.1%)，扩增有96例(88.9%)，与TCGA数据库的分布差异无统计学意义(2=1.761,P=0.185)；CSMD1基因扩增13例(12.0%)，二倍体有32例(29.6%)，缺失有63例(58.3%)，与TCGA数据库的分布差异有统计学意义(2=7.292,P=0.026)。

2.6 本院TNBC中MYC的扩增及CSMD1缺失与患者临床病理特征的关系 将本院TNBC患者的临床信息与MYC的扩增及CSMD1的缺失情况进行统计分析，发现MYC的扩增或CSMD1的缺失与患者的年龄、病理类型、T分级、N分级、M分级及临床病理分期无关(P>0.05)。见表3。

表3 我院TNBC中MYC扩增及CSMD1缺失与患者临床病理特征的关系 例

3 讨论

近20年来肿瘤基因组学发展迅猛，分子特征检测技术逐渐与传统肿瘤病理鉴别诊断相结合，出现了肿瘤病理分子分型的新模式，其中，成熟的分子特征包括了关键驱动基因的突变、CNV及蛋白产物的表达异常等[8]。在关键驱动基因的CNV中，癌基因ERBB2的扩增最具有临床意义，乳腺癌中HER2蛋白的过表达主要是编码基因ERBB2的扩增，针对HER2蛋白为靶点的曲妥珠单抗(trastuzumab)已经上市20年，其在治疗转移性HER2过表达型乳腺癌及胃癌中疗效确切，有效延长了相适应的病理分型患者的生存时间[9]。但是对于TNBC，暂时未见可以纳入临床指南的关键驱动基因CNV特征，只能使用排除性分类方式，进行模糊分类，这同样限制了针对TNBC的精准诊治的发展。

在本研究中，本课题组首先利用GISTIC2.0软件，对TCGA公共数据库中153例TNBC肿瘤组织进行全基因组的CNV分析，分别发现了8q24.21和8p23.2在TNBC显著扩增及缺失，提示我们8号染色体在TNBC肿瘤组织中的高度不稳定，而这一现象已被众多研究者证实，并指出8p的缺失与8q的扩增具有相关性[10-11]。一般认为，肿瘤基因组中发生扩增的区段一般包含了重要的癌基因，而缺少的区段则往往含有关键的抑癌基因[12]。利用基因组浏览器，我们能将8q24.21的扩增峰定位在MYC基因，而8p23.2的缺失主体为CSMD1基因，表明TNBC中MYC基因的扩增和CSMD1基因的缺失是值得我们研究的。

虽然未见CSMD1在TNBC样品中缺失率的报道，但能明确的是，乳腺癌中存在一定比例的CSMD1基因缺失情况[13]。近年来的系列研究已经证实，CSMD1蛋白在肿瘤组织中表达缺失与浸润性乳腺癌的高病理分级和差的预后相关[14]；在乳腺癌细胞中，沉默CSMD1能促进细胞体外的增殖、迁移和侵袭，并促进乳腺癌细胞体内的成瘤及转移，这表明CSMD1在乳腺癌中起抑癌基因的作用[15]。我们的研究发现，CSMD1基因在TCGA及本院TNBC样品中的缺失率分别为67.1%和58.3%，其中TCGA中CSMD1基因的缺失与TNBC患者癌组织的T分级相关，但我院的样品检测并不支持相关结果，其原因可能是本研究的TNBC样品数依然不足，高T分级样品较少(T3～T4占比均<17%)，难以得到稳定的统计学分析结果，此外，与MYC扩增情况类似，本研究并未发现CSMD1基因缺失与TNBC患者临床病理特征的明确相关性，这提示我们CSMD1缺失和MYC扩增可能是TNBC较为普遍的分子特征，而不是TMBC内部分型的标志物。

大量的研究[16-19]指出，MYC基因是重要的癌基因，其扩增导致的MYC蛋白过表达能通过干扰多条信号通路，直接或间接促进肿瘤细胞的合成代谢和细胞周期运行，维持肿瘤细胞的高增殖和低凋亡，还能通过直接转录多种生长因子促进肿瘤组织血管的新生和促癌微环境的形成，最终推动肿瘤的恶性进展及放化疗抵抗。在TNBC的临床组织中，有多个课题组均发现MYC基因的扩增现象，其扩增例数占比在50%～89%之间[20-21]，其数据波动较大的主要原因是，采用的检测方法及对应的阈值均有不同，且暂无统一的标准。在我们的样品和TCGA数据库中都观察到MYC基因的显著扩增，其占比分别为83.0%和88.9%，因为缺少不同乳腺癌分子病理亚型的数据，我们暂时无法确定MYC基因是否能作为TNBC的辅助诊断分子标志物，而回答这一问题将是本课题组后续的研究方向。