乳腺浸润性导管癌中生物钟基因NPAS2的表达及临床病理分析*

王爱武,钟碧玲,周扬帆,王贵明,陈艳宇,李亦明,谭夕

广东省第二人民医院、广东省应急医院病理科(广东广州 510317)

昼夜节律的主要功能为协调、控制哺乳动物每天24 h的生理与行为过程，昼夜节律的产生依赖于多种生物钟基因的转录-翻译反馈环路[1]。生物钟基因NPAS2(neuronal PAS-domain protein 2)是产生和维持周期节律的重要调控因子[2]，生物钟基因异常在恶性肿瘤组织中普遍存在。流行病学研究发现乳腺癌的发生与生物节律紊乱有关[3]。另一方面，研究还发现NPAS2高表达与乳腺癌患者预后相关，NPAS2可作为判断乳腺癌患者预后的指标之一[4]。最近国内有研究显示，NPAS2在人体腹腔恶性肿瘤中普遍表达下调或缺失[5]，雌激素受体(ER)、人表皮生长因子受体-2(HER2)表达状况与乳腺癌治疗、预后密切相关，乳腺癌NPAS2下调或缺失与ER、HER2表达状况以及其他临床病理特征之间的关系，目前国内很少报道。阐明NPAS2与乳腺癌组织内ER、HER2表达状况的关系，有助于优化乳腺癌治疗策略，为探讨乳腺癌时辰治疗提供理论依据。为此，本研究选取113例未经治疗的非特殊类型乳腺浸润性导管癌标本进行免疫组织化学染色，观察NPAS2表达情况，分析NPAS2的表达缺失与ER、HER2等临床病理特征的关系，并进一步分析复发病例NPAS2表达状况。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取广东省第二人民医院病理科2016年乳腺癌根治手术标本113例，所有病例术前未经新辅助放、化疗及内分泌治疗，病理诊断参照2012年WHO乳腺肿瘤分类标准，均由高年资主治以上病理医师诊断为非特殊类型乳腺浸润性导管癌，最后运用单盲法由一名主任医师复核诊断。

1.2 免疫组织化学染色 采用EnVision二步法对上述113例乳腺癌标本进行免疫组织化学染色。兔抗人NPAS2多克隆抗体购自美国Abcam公司，ER、孕激素受体(PR)、HER2、Ki-67四种一抗均为鼠抗人，购自Nov公司，二抗为鼠兔通用抗EnVision抗体，购自Dako公司。正常乳腺组织作为NPAS2、ER、PR、Ki-67的阳性对照，免疫组化染色3+阳性表达，同时FISH检测确认存在HER2基因扩增的乳腺癌档案材料作HER2的阳性对照，PBS代替一抗作空白对照。

1.3 免疫组化结果判读 NPAS2阳性定位表达于胞核，采用半定量双评分法评价：每张切片随机选取5个具有代表性的高倍视野。(1)计算肿瘤细胞中阳性细胞百分数，无阳性细胞为0分，≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；(2)细胞染色强度：无染色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分，重度染色为3分。总分数(0～12分)为以上两项之积，0分、1分为阴性，2～4分为弱阳性，6～8分为中等阳性，9～12为强阳性。由两名中级职称以上病理医师进行双盲法阅片，若评估意见不一致时，需重新对结果进行比较和讨论。

ER、PR阳性表达定位于胞核，判读标准参考2015年中国乳腺癌雌、孕激素受体免疫组织化学检测指南，将1%作为ER、PR表达阳性的临界值。

HER2结果判读参考美国临床肿瘤学会和美国病理学会临床实践指南专项更新，乳腺癌HER2检测指南(2019版)[6]:将>10%浸润癌细胞胞膜呈现完整的强染色(3+)定义为阳性，0及1+定义为阴性，将>10%浸润癌细胞胞膜呈现轻到中度完全性膜染色定义为2+，再经HER2基因FISH检测证实为阳性的病例归入阳性组。Ki-67存在肯定的胞核染色即为阳性，阳性强弱不作为评估参数。

1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件，NPAS2蛋白表达与ER阴性、ER阳性乳腺癌相关性评估采用2检验(常规2检验或校正2检验)。随访结果以Kaplan-Meier曲线表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者组织学分级情况及概况 113例乳腺浸润性导管癌患者均为女性，发病年龄25～75岁，平均(49.08±2.42)岁，组织学分级包括1级病例4例，2级50例，3级59例。

2.2 患者ER、HER2检测结果 113例乳腺癌病例中，88例癌组织呈ER阳性，25例显示ER阴性。同时，32例乳腺癌标本存在HER2过表达，81例显示HER2阴性。

2.3 ER阴性与阳性患者NPAS2表达缺失率比较 NPAS2在ER阴性病例的表达缺失率为20.00%(5/25)，较ER阳性病例的表达缺失率4.54%(4/88)明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 HER2阴性与阳性患者NPAS2表达缺失率比较 NPAS2在32例HER2过表达病例的表达缺失率为18.75%(6/32)，其余81例阴性病例的表达缺失率为3.70%(3/81)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 NPAS2免疫组化表达情况概况 NPAS2在正常乳腺导管上皮阳性表达(图1)，113例乳腺癌标本中有104例癌组织检测到NPAS2不同程度的阳性表达(图2、3)，9例呈阴性表达(图4)，表达缺失率为7.96%(9/113)。

图1 NPAS2 正常导管上皮阳性表达(Envision，×200)

图2 NPAS2癌组织中等强度阳性表达(Envision，×200)

图3 NPAS2癌组织强阳性表达(Envision，×200)

图4 NPAS2癌组织阴性表达(Envision，×200)

2.6 NPAS2在不同级别浸润性导管癌的免疫组化表达情况 NPAS2在不同级别浸润性导管癌的免疫组化表达情况见表1，不同级别浸润性导管癌肿瘤细胞均有NPAS2表达。分析NPAS2表达缺失情况发现，4例1级浸润性导管癌未见NPAS2表达缺失，2级浸润性导管癌的表达缺失率为2.00%(1/50)，3级浸润性导管癌的表达缺失率为13.56%(8/59)。

表1 NPAS2在113例不同级别浸润性导管癌中的免疫组化表达情况 例

整体比较(秩和检验)显示：3个级别的浸润性导管癌，其NPAS2表达差异无统计学意义(P>0.05)。再进行具体的两两分割比较，结合数据分析如下：

标本中1级浸润性导管癌例数过少，仅有的4例未出现NPAS2缺失表达，无法进行3组病例比较，只对2级、3级浸润性导管癌病例进行比较，2级浸润性导管癌的NPAS2表达缺失率2.00%(1/50)与3级浸润性导管癌15.69%(8/59)之间差异无统计学意义(修正后2=3.371，P=0.066)。

再将109例2级、3级浸润性导管癌病例合并分组再进行表达差异分析，即表达缺失与弱阳性表达病例合并(分别为14例、26例)、中等强度阳性与强阳性表达合并(分别为36例、33例)，两组之间NPAS2表达差异无统计学意义(2=3.011，P>0.05)。

2.7 113例浸润性导管癌的ER状态及HER2基因过表达情况 免疫组化染色方法检测肿瘤细胞ER表达，88例标本为ER阳性(图5)，25例为ER阴性。HER2基因免疫组化过表达病例共32例(图6)，免疫组化阴性表达病例81例。

图5 癌组织ER阳性表达(Envision，×200)

图6 癌组织HER2阳性表达(Envision，×200)

分析9例NPAS2阴性表达病例的分布，ER阳性病例组出现4例，表达缺失率4.54%(4/88)，ER阴性病例组有5例，表达缺失率为20.00%(5/25)，ER阴性组病例较ER阳性组病例明显升高，差异有统计学意义(校正后2=4.41，P<0.05)。同时，6例NPAS2阴性表达病例出现在32例HER2基因过表达病例，表达缺失率为18.75%(6/32)，其余81例阴性病例中见3例NPAS2阴性表达，表达缺失率为3.70%(3/81)，两组缺失差异有统计学意义(校正后2=5.181，P<0.05)。

2.8 NPAS2在乳腺浸润性导管癌的表达与临床病理特征的关系 NPAS2在肿瘤细胞中的表达与患者的ER状态和HER2基因有无过表达有关，与PR状态、年龄、肿块大小、Ki-67增殖指数、淋巴结有无转移、临床分期无关。见表2。

表2 NPAS2在113例浸润性导管癌中的表达及其与乳腺癌临床病理特征的关系 例

2.9 随访结果 截止2019年11月30日，113例患者中有87例被成功追踪随访，最长随访时间为47个月。随访病例中，有1例行单纯肿瘤切除术患者发生原位复发、4例发生远处转移。分析5例复发、转移病例的NPAS2表达情况，1例显示手术切除标本为NPAS2强阳性表达，4例为弱阳性。此外，4例发生远处转移的病例，手术当时的临床分期均为中、晚期(Ⅲ期、Ⅳ期)，见表3、图7。

表3 复发、转移病例的NPAS2表达状况与临床病理情况

图7 无复发转移PFS的K-M曲线

3 讨论

昼夜节律调节着人体数百种功能，昼夜节律紊乱与多种疾病的发生有关[7]。肿瘤患者常常可以观察到昼夜节律紊乱现象[8]，作为肿瘤抑制因子的生物钟基因及其相关蛋白产物在不同水平上参与到细胞分裂、增殖、凋亡及细胞周期调控、DNA损伤修复等多方面过程。NPAS2蛋白与BMALI蛋白形成异源二聚体，与靶基因启动部位的e盒结合，启动其他核心昼夜节律基因，如PER1、PER2、PER3及CR1、CR2，从而调节哺乳动物的昼夜节律，同时，NPAS2/BMAL1异二聚体的基因产物还可以调节若干原癌基因，与C-MYC基因相互作用[9]。越来越多的证据表明，NPAS2及其他昼夜节律基因参与了乳腺癌形成及发展过程[10-11]，本组研究显示NPAS2在不同级别浸润性导管癌中均有表达，1级浸润性导管癌病例未观察到表达缺失，2级、3级浸润性导管癌病例的表达缺失率随级别上升而增加，提示NPAS2与细胞增殖有关，可能存在负性调节作用，很可能是乳腺癌发生发展过程中的早期分子事件。因本组研究材料以2、3级病例为主，尚需加大样本量平衡各组之间的比例，进一步明确NPAS2表达情况与浸润性导管癌级别之间的关系。

文献报道，体内循环激素可以调节前脑及外周组织的昼夜节律基因表达[12]，人体内节律性分泌的激素具有调节特定组织中昼夜节律基因表达的能力，提示昼夜节律基因与激素生成之间有相关性。ER是乳腺癌重要的诊断、治疗靶点，本研究观察了非特殊类型浸润性导管癌的NPAS2基因表达状况与ER状态之间的关系，结果显示，癌旁正常乳腺导管上皮可同时检测到ER、NPAS2的表达，NPAS2表达缺失更多见于ER阴性的浸润性导管癌细胞，提示NPAS2可能是乳腺癌发生发展过程中潜在的肿瘤抑制因子。Mocellin等[13]的大样本系列研究表明，NPAS2基因变异与ER阴性乳腺癌密切相关，本组研究在组织学水平上发现NPAS2基因表达与ER状态密切相关，与Brzezinski等[14]的研究结果一致，提示检测NPAS2表达情况可能对预测乳腺癌患者预后具有重要意义。

正常机体的昼夜节律在24 h内受到精细的信号回路调控，研究证实，昼夜节律信号通路存在正、负反馈调节，但是NPAS2与ER在细胞内的信号交联通路及相关调节机制未完全阐明。文献报道NPAS2、ER信号通路的下游靶基因包括C-MYC、CyclinD1、CDK4等多个肿瘤相关基因[15]，本组研究发现ER阴性浸润性导管癌细胞的NPAS2表达缺失率明显升高，提示ER与NPAS2在浸润性导管癌的发展过程中密切相关。Benna等[16]的研究发现，ERa阳性乳腺癌组织高表达CLOCK，进一步利用乳腺癌细胞株进行实验，发现乳腺癌细胞内CLOCK蛋白水平与mRNA水平均升高，具体机制为乳腺癌细胞内E2启动子促进ERa与CLOCK启动子雌激素启动元件(ERE)结合，从而上调了CLOCK的转录水平，进而调节乳腺癌细胞的增殖。据此，我们推测在乳腺癌发生、发展过程中，生物钟基因NPAS2可能通过相似的分子通路与ER相互作用。

关于NPAS2与HER2基因相互作用的报道非常有限[17]，但是，ER、HER2信号通路均可以与原癌基因C-MYC发生信号交联，本组研究在浸润性导管癌组织学标本中发现NPAS2表达缺失与HER2基因过表达存在密切相关性，提示我们可以进一步通过研究浸润性导管癌的C-MYC状况来揭示NPAS2与HER2基因之间的作用机制。本组病例最长随访时间47个月，生存分析显示复发病例NPAS2表达下降为主。结合此次研究可知，NPAS2与ER状态、HER2基因过表达有着高度相关性，或可能成为今后乳腺癌节律治疗的切入点，不仅丰富了现有研究体系内容，还为今后临床治疗工作提供了科学指导，成为本研究创新之所在。

综上所述，生物钟基因NPAS2可能与乳腺浸润性导管癌的发生有关，其表达缺失与乳腺浸润性导管癌组织ER阴性、HER2过表达存在高度相关性，可能与乳腺癌进展有关。