STAT3、MMP-2蛋白和mRNA在维吾尔族乳腺癌患者中的表达及意义*

周梅,阿迪拉·斯依提,叶明,岳娜,陈钰炜,王书芹

1新疆医科大学附属肿瘤医院病理科(新疆乌鲁木齐 830000)；2中山市中医院病理科(广东中山 528400)

乳腺癌已经成为全世界妇女的严重威胁，也是第二大致死原因。乳腺癌在全世界妇女每年发病率有100多万[1]，而乳腺癌的遗传学易感性和临床预后存在着种族和地域差异[2]，近年维吾尔族乳腺癌发病率呈逐年上升趋势，因此探寻维吾尔族乳腺癌的发生、发展机制具有重要意义。信号转导和转录激活因子3(STAT3)是一种信号转导和转录激活蛋白，可与酪氨酸磷酸化通道偶联而被激活，磷酸化的STAT3可介导多种信号分子调控肿瘤增殖及凋亡，影响肿瘤的进展[3]。STAT3在多种恶性肿瘤中被激活，例如肺癌、胰腺癌和肝细胞性肝癌[4]，最近研究数据表明STAT3参与乳腺癌的进展、增殖、转移和耐药机制中。MMP-2(Ⅳ型胶原酶)是高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶，MMP-2在乳腺癌转移中发挥着重要作用，研究表明STAT3介导的细胞转移机制是通过上调MMP-2实现的[5-6]，STAT3和MMP-2与维吾尔族乳腺癌患者关系的报道较少，两者的表达是否与其他民族存在差异尚未明确，本研究运用RT-PCR和免疫组化的方法检测STAT3和MMP-2蛋白和mRNA在维吾尔族乳腺癌中的表达，分析其与乳腺癌各临床病理指标间的关系，探讨两者在维吾尔族乳腺癌癌变过程中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年1月至2014年12月新疆医科大学附属肿瘤医院病理科存档乳腺蜡块110例，其中维吾尔族乳腺癌80例，正常乳腺组织30例，所有病例均为女性，乳腺癌患者的年龄分布为27～81岁，平均(54±11.6)岁。病理类型均为非特殊类型浸润性乳腺癌，乳腺癌的组织学分级及分期标准参照2012年世界卫生组织的标准。

1.2 主要试剂 免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥。RNA提取试剂盒QIAquick PCR Purification Kit购自美国QIAGEN公司，逆转录试剂盒购自Promega生物公司，SYBR Real-Time PCR试剂盒购自大连Takara公司。

1.3 研究方法

1.3.1 免疫组化 所有标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，敷贴于10%多聚赖氨酸预处理的载玻片上，将石蜡切片置于60℃烤箱烘烤2 h，将切片按浓度梯度浸入二甲苯和酒精脱蜡，柠檬酸盐缓冲液高压修复抗原4 min，加过氧化氢10 min，阻断内源性过氧化物酶活性，切片用10%的山羊血清阻断，STAT3(1∶100)、MMP-2(1∶150)稀释抗体，一抗孵育2 h，二抗孵育30 min，DAB显色，脱水，封片。

1.3.2 提取总RNA与合成cDNA 取样本6片，厚6 μm，用RNA提取试剂盒(美国，QIAGEN)提取总RNA，测其纯度(紫外分光法)，按逆转录试剂盒(Promega生物公司)说明书进行反转录，将500 ng总RNA加入20 μL反应体系中，经37℃ 15 min、85℃ 5 s、4℃延伸，获得cDNA后行PCR检测或冰箱(-20℃)保存备用。

1.3.3 RT-PCR检测 检测STAT3和MMP-2 mRNA的相对表达量，RT-PCR具体操作步骤按试剂盒说明书进行。反应体系：SYBR 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，加入去离子水至20 μL；在实时荧光定量PCR仪上进行热循环反应，PCR反应条件：95℃ 30 min预变性；95℃ 5 s，60℃ 30 s，PCR循环40次；溶解并绘制溶解曲线：95℃ 5 s、60℃ 30 s、95℃ 。每份样本设3个复孔，重复3次。记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数，即Ct值。采用△Ct法计算乳腺癌组织和正常乳腺组织mRNA的相对表达量，△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因。引物由上海生工生物公司合成。STAT3上游引物：5′-CAGTGACCAGGCAGAAGA-3′，STAT3下游引物：5′-ACTCCATCGCTGACAAAA-3′；MMP-2上游引物：5′-ATAACCTGGATGCCGTCGT-3′，MMP-2下游引物：5′-AGGCACCCTTGAAGAAGTAGC-3′；内参GAPDH上游引物：5′-TCGACCAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，GAPDH下游引物：5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3′。

1.4 结果判定 STAT3蛋白阳性表达为胞核内出现棕黄色颗粒，MMP-2蛋白阳性表达为胞质出现棕黄色颗粒。阳性染色强度评分：无染色为0分，微弱染色为1 分，清晰染色且细胞质或细胞核呈棕黄色为2 分，细胞质与细胞核呈深棕色为3分；阳性细胞数评分：无阳性细胞为0 分，阳性细胞数≤20%为1 分，阳性细胞数21%～50%为2 分，阳性细胞数>50%为3分；上述两项评分相乘，0～2分为阴性，≥3 分为阳性表达。

2 结果

2.1 检测STAT3和MMP-2蛋白在维吾尔族乳腺癌和正常乳腺组织中的表达 采用免疫组化的方法检测STAT3和MMP-2蛋白的表达，结果表明STAT3和MMP-2蛋白在乳腺癌组织中高表达。见图1。STAT3蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率为77.5%，在正常乳腺组织中的阳性表达率为56.7%，STAT3蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率明显高于正常乳腺组织(P<0.05)；MMP-2蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率为70%，而在正常乳腺组织中的阳性表达率为36.7%，MMP-2蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率也明显高于正常乳腺组织(P<0.05)。见表1。

表1 STAT3和MMP-2蛋白在维吾尔族乳腺癌和正常乳腺组织中的表达 例

2.2 STAT3和MMP-2蛋白在维吾尔族乳腺癌中表达的关系 在维吾尔族乳腺癌中，STAT3和MMP-2蛋白的表达具有较高的一致性，相关性分析显示，STAT3和MMP-2蛋白的表达呈正相关(r=0.235，P<0.05)。见表2。

注：A：乳腺癌组织中STAT3的阳性表达；B：乳腺癌组织中MMP-2的阳性表达图1 免疫组化染色(IHC，×100)

表2 维吾尔族乳腺癌组织STAT3和MMP-2蛋白表达的相关性分析 例

2.3 STAT3和MMP-2蛋白表达与乳腺癌临床病理特征的关系 在维吾尔族乳腺癌中，STAT3和MMP-2蛋白的阳性表达率与乳腺癌肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期均具有相关性(P<0.05)，肿瘤体积越大、组织学分级越高、有淋巴结转移、TNM分期越高的乳腺癌STAT3和MMP-2蛋白的阳性表达率越高。见表3。

表3 维吾尔族乳腺癌组织STAT3和MMP-2蛋白表达与临床病理特征的关系 例

2.4 比较STAT3和MMP-2 mRNA在维吾尔族乳腺癌组织与正常组织中表达的差异 STAT3和MMP-2 mRNA水平运用相对定量法通过2-ΔΔct计算。观察溶解曲线及扩增循环图，了解扩增情况。STAT3基因mRNA在维吾尔族浸润性乳腺癌中的相对表达量明显高于正常乳腺组织，差异有统计学意义(P<0.05)；MMP-2 mRNA在维吾尔族浸润性乳腺癌中的相对表达量明显高于正常乳腺组织，差异也有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 STAT3和MMP-2 mRNA在维吾尔族乳腺癌与正常乳腺组织中的相对表达量

2.5 比较STAT3和MMP-2 mRNA表达与乳腺癌临床病理特征的关系 RT-PCR结果显示，STAT3 mRNA在乳腺癌淋巴结转移组中的相对表达量明显高于无淋巴结转移组(P<0.05)；STAT3 mRNA在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌组织中相对表达量明显高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；STAT3 mRNA表达与维吾尔族乳腺癌淋巴结转移状况、临床分期有关，而与组织学分级、直径无显著相关性(P>0.05)。MMP-2 mRNA在乳腺癌淋巴结转移组中的相对表达量也明显高于无淋巴结转移组(P<0.05)；MMP-2 mRNA的相对表达量在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌明显高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)。见表5。

表5 维吾尔族乳腺癌组织STAT3和MMP-2 mRNA表达与临床病理特征的关系

2.6 STAT3和MMP-2 mRNA表达与乳腺癌患者预后的关系 所有患者随访5年，生存63例，死亡15例，绘制维吾尔族乳腺癌患者术后1～60个月STAT3和MMP-2高、低表达者的生存曲线，STAT3高表达者及低表达者术后的总生存率分别为73.48%(36/49)、93.10%(27/29)，MMP-2高表达者及低表达者术后的总生存率分别为71.43%(35/49)、96.55%(28/29)，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2、3。

图2 不同STAT3表达水平维吾尔族乳腺癌患者5年生存曲线

3 讨论

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤，也是全世界妇女癌症相关死亡的主要原因[7]，尤其是新疆维吾尔族患者，复发和转移的数量非常高，因此，寻找新的乳腺癌预后标志物和治疗靶点具有重要意义。

众所周知，Janus激活的激酶信号转导和转录激活因子(JAK-STAT)信号通路在许多恶性肿瘤中起关键作用，JAK/STAT信号通路的表达水平与肺腺癌、结直肠癌[8]和食管鳞癌患者的淋巴结转移和OS有关[9]。STAT3是JAK-STAT3信号通路的关键调节因子。STAT3是STATs家族的重要成员之一，因其与肿瘤的关系最为密切而成为目前研究的热点，是多种恶性肿瘤的致癌基因[10]。在许多肿瘤中，激活的STAT3参与了细胞增殖、促进血管生成、侵袭、免疫抑制和抗凋亡[11]，然而，维吾尔族乳腺癌与JAK2/STAT3通路的关系仍不清楚。

图3 不同MMP-2表达水平维吾尔族乳腺癌患者5年生存曲线

Sapio等[12]研究显示STAT3在乳腺癌组织中异常高表达，对肿瘤的发生发展起着重要作用。Liu等[13]研究发现STAT3在乳腺癌组织中的表达与肿瘤临床分期和侵袭转移密切相关。从本研究结果显示，STAT3蛋白和mRNA在维吾尔族乳腺癌中的阳性表达明显高于正常乳腺组织，且STAT3蛋白的表达水平与肿瘤体积大小、组织学分级、淋巴结转移、临床分期均明显相关，在肿瘤较大、发生淋巴结转移、组织学分级较高、临床分期较晚的维吾尔族浸润性乳腺癌患者中STAT3蛋白的阳性表达率明显升高，STAT3 mRNA的相对表达量与维吾尔族乳腺癌淋巴结转移状况、临床分期有关，提示在维吾尔族乳腺癌患者中，STAT3表达水平越高肿瘤的增殖速度越快，侵袭性越强，易发生转移，TNM分期越晚，预后越差，STAT3可能参与调控维吾尔族非特殊类型浸润性乳腺癌的发生和发展，STAT3过表达是影响维吾尔族乳腺癌患者预后的独立因素。目前许多研究集中在 JAK1/2抑制剂对各种实体肿瘤的生长、增殖、凋亡、血管生成和转移的治疗效果，近年来发现了一些新的特异性STAT3抑制剂，也有报道称，STAT3抑制剂在小鼠乳腺癌模型中具有抗癌和免疫刺激作用[14]，靶向STAT3的联合治疗可能是乳腺癌的最佳治疗方案[15]。

研究发现STAT3还可以介导IL-6诱导的MMP-2的表达以及乳腺癌细胞的迁移。Ma等[16]报道抑制STAT3磷酸化可以减少MMP-2在乳腺癌中的表达，本研究结果也显示STAT3和MMP-2蛋白的表达具有明显的相关性(P<0.05)。MMP可降解Ⅳ型胶原，促进基底膜破裂，MMP-2与肿瘤的侵袭和转移过程以及肿瘤细胞的高侵袭能力有关[17]。据报道活化的MMP-2能增强肿瘤细胞穿透基底膜基质的能力，可促进多种肿瘤包括胰腺癌、肝细胞癌和肺癌等的转移[18]。MMP-2表达的上调与乳腺癌患者的预后不良相关[19]。本研究结果显示MMP-2蛋白和mRNA在维吾尔族乳腺癌中的阳性表达明显高于正常组织；MMP-2的阳性表达率与维吾尔族乳腺癌肿瘤大小、组织分级、淋巴结转移、临床分期相关(P<0.05)，MMP-2蛋白在肿瘤体积较大、组织学分级较高、发生淋巴结转移、TNM分期高的维吾尔族乳腺癌组织中的表达量明显高于肿瘤体积较小、组织学分级较低、无淋巴结转移组和TNM分期较低的乳腺癌，MMP-2 mRNA的表达与乳腺癌淋巴结转移和肿瘤分期有关，MMP-2表达增高提示乳腺癌的增殖速度较快，侵袭性较强，易转移，TNM分期较晚，预后欠佳。

综上所述，STAT3和MMP-2与乳腺癌的临床病理特征有关，两者过度表达与预后不良有密切关系，提示STAT3和MMP-2可能参与维吾尔族乳腺癌的发生发展过程，STAT3和MMP-2高表达在乳腺癌的细胞分化、浸润转移中发挥重要的作用，本研究可能为研究乳腺癌发生机制和治疗靶点提供理论依据。