赖氨酸甲基转移酶SETD7在小鼠急性肾损伤中的作用*

张涛,聂嘉仪,梁桦,徐枫,刘本铨,喻文强,王汉兵

佛山市第一人民医院麻醉科(广东佛山 528000)

药物滥用导致的急性肾损伤(AKI)在世界范围内发生率逐年上升，临床表现为肾功能在短时间内丧失，是一种常见的危机生命的重症[1]。随着手术后AKI造成住院周期延长和病死率增高，越来越多的临床医师也关注到围手术期AKI的发生和防治。AKI主要病理生理特征表现为肾小管上皮细胞凋亡和炎症反应，其特征是肾功能迅速下降，具有较高的发病率和病死率[2-3]。组蛋白的甲基化是表观遗传修饰的其中一大表现形式[4-5]，近期实验结果显示，在AKI中，组蛋白甲基化酶(HMTs)的活性调节发挥着关键性作用[6]。SETD7是一种参与基因调控的组蛋白H3K4赖氨酸甲基转移酶，SETD7的异常表达与包括细胞增殖分化、炎性反应以及神经性疼痛等有关[7]。因此，SETD7被认为是新表观遗传药物开发的目标，但其在AKI中的作用及机制尚未见相关研究报道。为此，2020年4—10月，本研究拟观察SETD7在小鼠AKI中的作用，并探讨有关机制，为临床治疗AKI提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理 实验动物为C57BL/6、雄性、健康小鼠，周龄8～10周，体重20～30 g，由广东省医学实验动物中心提供，同时得到动物伦理委员会准可。经随机数字表法，将实验动物归入下述4组(n=6)：对照组(CON组)、DMSO+对照组(DMSO-CON组)、AKI组(FA-AKI组)、SETD7抑制剂+ AKI组(PFI-2-AKI组)。以研究成果[8]为参考，将250 mg/kg的叶酸(美国Sigma)经腹腔单次注入至FA-AKI组实验动物体内，以此完成AKI模型的构建。叶酸溶液配制方法：叶酸 125 mg，NaHCO3252 mg，H2O 10 mL；参照文献[9]，PFI-2-AKI组小鼠在制备AKI模型前1 h腹腔注射甲基转移酶SETD7抑制剂PFI-2(美国Target Mol)：将0.2 mmol PFI-2稀释在0.2 mL 0.1% DMSO(载体)中。DMSO-CON组单纯腹腔注射0.1% DMSO 0.2 mL。PFI-2-AKI组小鼠制备模型成功后72 h内饮食及精神状况良好、活动状态未见明显异常。

1.2 血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)检测 72 h后采集眼眶内眦血，静置离心后，取上层血清。采用全自动生化分析仪(型号7020，HITACHI公司，日本)检测血清BUN和 Cr。

1.3 肾小管损伤程度评价 肾组织先接受固定处理，再行常规石蜡包埋切片操作，最后为脱蜡脱水处理。借助HE以及PAS染色法，展开组织病理学评价。借助光镜(日本尼康)对肾组织受损状况进行查看。以研究成果[10]为参考：刷状缘脱落、已有管型各为2分；肾小管大幅扩张细胞扁平、管腔中见脱落坏死细胞但无碎片或管型出现、刷状缘损伤则各为1分。

1.4 肾组织炎症细胞检测 对石蜡切片依次行脱蜡→水化→抗原修复→封闭内源性过氧化物酶(PO)活性→封闭非特异性蛋白结合位点处理后。分别由MPO (美国Abcam)、CD3(美国Calbiochem)、F4/80(美国Serotec)一抗孵育，之后于4℃下经夜放置。于室温环境中对相应二抗行60 min孵育处理，所用试剂为ABC试剂(美国Vector Laboratories)。DAB显色，苏木精溶液复染，脱水后中性树脂封片。每张切片随机选取5个视野连续拍照(Nikon公司，日本)，计数阳性细胞，取平均值。

1.5 肾组织炎症因子检测 借助RT-PCR法，对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA、白细胞介素(IL)-1β与IL-6表达进行测定。根据试剂盒(美国Invitrogen)所示步骤，经TRIzol法完成肾组织总RNA的抽提，借助核酸蛋白定量仪(美国UNIKO)对样品RNA纯度进行评定，完成cDNA的反转录合成。引物序列详情见表1。借助荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)，对Ct值进行测定，通过2-ΔΔCt法对目标基因表达强度进行测定。

表1 各目的基因引物序列

2 结果

2.1 在尿素氮(BUN)水平、肌酐(Cr)水平以及肾小管损伤评分方面的比较 对比于CON组，PFI-2-AKI组BUN、Cr水平及肾小管损伤评分均为显著偏高表现(P<0.05)；与FA-AKI组比较，PFI-2-AKI组显著偏低(P<0.05)。但对比CON组同DMSO-CON组，则未发现显著不同 (P>0.05)，见表2。CON组以及DMSO-CON组均没有发现肾组织明显病理学变化；在PFI-2-AKI组，实验动物肾组织形态主要表现为肾小管肿胀，还有肾小管上皮细胞(RTEC)水样变性、小部分坏死以及空泡变性，肾间质轻微水肿与充血；在FA-AKI组，表现为肾小管管腔大幅扩张，显示扁平状上皮细胞，分布缺乏规则性；RTEC见明显坏死、脱落；肾间质水肿、充血症状明显。见图1～2。

表2 4组小鼠血清BUN、Cr 水平和肾小管损伤评分的比较

注：A:CON组；B:FA-AKI组;C:DMSO-CON组;D:PFI-AKI组图1 4组小鼠肾组织形态学的比较(HE染色,×200)

注：A:CON组；B:FA-AKI组;C:DMSO-CON组;D:PFI-AKI组图2 4组小鼠肾组织形态学的比较(PAS染色，×200)

2.2 在肾组织MPO+、F4/80+以及CD3+这3类细胞数量方面的比较 与CON组比较，PFI-2-AKI组与FA-AKI组显著偏多(P<0.05)；对比于FA-AKI组，PFI-2-AKI组显著偏少(P<0.05)；DMSO-CON组与CON组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图3～5。

表3 4组小鼠肾组织MPO+、F4/80+和CD3+细胞数比较

2.3 TNF-α、MCP-1、IL-1β与IL-6这四者mRNA表达水平的比较 与CON组比较，PFI-2-AKI组显著偏高(P<0.05)；与FA-AKI组比较，PFI-2-AKI组为显著偏低表现(P<0.05)；DMSO-CON组与CON组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 4组小鼠肾组织TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1 mRNA表达水平的比较

3 讨论

肾脏既是各种毒素排泄的主要器官，又是毒物攻击的主要靶器官。围手术期肾脏既是调节水、电解质和维护酸碱平衡的重要器官，更多地承担着各种药物的代谢。作为围手术期医生，密切关注术前、术中和术后各种重要脏器保护，例如脑保护、肺保护和肝肾保护等。临床上围手术期患者AKI发生率很高，早期进行干预、术中予以肾保护策略，对于患者围手术期的快速康复意义重大，这就要求我们更多地去研究和了解AKI发生的机制。

注：A:CON组；B:FA-AKI组;C:DMSO-CON组;D:PFI-AKI组图3 4组小鼠肾组织MPO+细胞比较(免疫组化，×200)

注：A:CON组；B:FA-AKI组;C:DMSO-CON组;D:PFI-AKI组图4 4组小鼠肾组织F4/80+阳性细胞比较(免疫组化，×200)

注：A:CON组；B:FA-AKI组;C:DMSO-CON组;D:PFI-AKI组图5 4组小鼠肾组织CD3+细胞比较(免疫组化，×200)

叶酸诱导肾损伤模型目前被广泛用于急性肾损伤及慢性间质纤维化，而且叶酸诱导剂量高低与肾损伤程度密切相关。因此此项采取腹腔注射叶酸途径进行小鼠AKI模型的构建，对临床药物潜在AKI风险进行模拟。众多研究表明，在AKI的病理生理过程中，表观遗传学调控施加了一定影响[11]。表观遗传修饰所指为在未改变DNA序列的基础上，经由修饰DNA以及相关蛋白行为实现对基因表达的调控[12]，以甲基化、磷酸化、乙酰化等为主[11]。

在组蛋白以及非组蛋白的赖氨酸(Lys)甲基化中，SETD7发挥着重要的调节作用[13-15]。越来越多的研究表明，SETD7通过介导各种蛋白质的赖氨酸残基的甲基化来调节细胞生长，细胞凋亡和氧化应激[16-17]，而PFI-2作为组蛋白赖氨酸甲基转移酶SETD7特异性的抑制剂，能够有效抑制SETD7活性[18]。本研究发现，FA-AKI组小鼠BUN、Cr水平、肾小管损伤评分较CON组明显升高。与FA-AKI组小鼠比较，PFI-2-AKI组小鼠在给予SETD7特异性抑制剂PFI-2后，BUN和Cr水平明显降低，肾小管损伤减轻，提示抑制SETD7活性可减轻小鼠的急性肾损伤。

AKI通常与促炎性细胞因子和化学因子升高有关，导致白细胞浸润。在AKI模型中，炎症由凋亡细胞传递的分子信号，激活的模式识别受体，免疫细胞的多样化募集触发[19]。MPO、CD3、F4/80依次是中性粒细胞、T细胞、巨噬细胞的标志物[20-21]。本研究发现，FA-AKI组小鼠肾组织MPO、F4/80和CD3阳性细胞增加，提示中性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞浸润增多。而PFI-2-AKI组小鼠肾组织的中性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞数明显减少，提示在AKI过程中，SETD7的活化能募集炎症细胞在肾脏浸润，加重AKI。

研究证实，在坐骨神经慢性压迫损伤(CCI)模型中，SETD7调节CCI大鼠小胶质细胞和炎性介质的表达，通过鞘内注射PFI-2调节小胶质细胞变性及IL-1β、IL-6的表达，减轻CCI引起的神经病理性疼痛[9]。此次研究还获得以下结果，AKI模型组实验动物肾组织TNF-α、MCP-1、IL-1β与IL-6这四者mRNA表达升高，PFI-2-AKI组实验动物这4项指标则明显降低。这提示在AKI模型中小鼠SETD7的活化促进了中性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1等炎性因子，而这些炎性因子的释放，进一步加重了AKI。在以上所有检测指标中，DMSO-CON组与CON组比较差异无统计学意义(P>0.05)，也进一步排除了DMSO对于本研究结果可能造成的影响。

本研究采用的是SETD7特异性药理抑制剂，没有使用SETD7基因条件性敲除小鼠。因此不能排除药理性抑制剂对全身其他组织细胞造成的间接性影响而减轻AKI，这是本实验的局限性。而SETD7是通过何种信号通路减少炎症细胞的浸润以及下调炎症因子的表达减轻AKI，本实验未能更深一步的阐述，也是本研究团队需要进一步努力的方向。综上所述，SETD7可能通过调控炎症反应促进了急性肾损伤。