缺氧诱导因子-1α去苏素化修饰在特发性肺纤维化中的临床意义*

王涛,宋晓萍,孙莹,白利芳,肖祖琳,孙伟△

1大连大学附属中山医院呼吸一科(辽宁大连 116011)；2内蒙古自治区人民医院呼吸与危重症科(内蒙古呼和浩特 010017)

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是慢性进展性疾病，诊断后的生存时间不足3.5年[1]。目前虽有尼达尼布、吡非尼酮药物用于治疗IPF，但病死率无明显降低[2]。因此，解析IPF进展的发病机制、寻求新的药物靶点是我国对IPF防治的迫切需求和面临的巨大挑战。目前关于IPF的发病机制不清。新近研究发现，缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor，HIF-1α)是组织细胞对缺氧感应和调控的一类关键转录因子，低氧状态下HIF-1α通过调节转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素-17(IL-17)、结缔组织生长因子(CTGF)等多种致器官纤维化细胞因子的靶基因参与了IPF的整个进程[3-6]。已有的研究也表明，HIF-1α存在苏素化修饰(small ubiquitin-related modifier,SUMO)的精细化调节，SUMO-1 化是重要的蛋白质翻译后手段且是一个动态平衡的修饰过程[7-8]。常氧状态下SUMO-1通过酶联反应对HIF-1α进行水解，维持人体的正常生理功能，但在低氧状态时可被特异性蛋白酶1(SENP1)催化的去SUMO修饰将其从靶蛋白上去除，使HIF-1α蛋白过表达[9-11]。所以本研究提出如下假设：在低氧条件下，SENP1催化的去SUMO化影响了SUMO化修饰对HIF-1α蛋白的降解，使其过度活化多种细胞因子，最终导致了IPF的进展。为验证此假说，本研究检测IPF患者血清中HIF-1α、SENP1的水平变化并分析两者的相关性，进一步探讨HIF-1α、SENP1在IPF中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从2019年3月至2020年3月于我院临床诊断为IPF的患者中，选取30例作为观察组，另抽取同期健康体检者30例作为对照组，所有受试者均知情并同意参加本研究。本研究经大连大学附属中山医院伦理委员会审核批准。两组年龄、性别、吸烟史等差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 两组一般资料比较

1.2 诊断标准 所有患者均为临床诊断且符合 2011 年美国胸科学会/欧洲呼吸学会/日本呼吸学会/拉丁美洲胸科协会(ATS/ERS/JRS/ALAT)联合发表的《特发性肺纤维化诊治指南的诊断标准》。

排除标准：具有糖尿病等代谢性疾病者，合并严重肝肾疾病、恶性肿瘤者，近2个月内曾使用糖皮质激素、免疫抑制剂等药物治疗者。

IPF急性加重(AEIPF)的判断标准:(1)IPF患者近30 d内不明原因出现呼吸困难加重;(2)高分辨率CT(HRCT)在原有病变的基础上出现新发双肺磨玻璃影伴或不伴实变影;(3)气管分泌物或肺泡灌洗液病原学检查没有感染依据;(4)除外左心力衰竭、肺栓塞、急性肺损伤等诱因。

根据该判定标准，IPF患者30例中，AEIPF患者为11例，稳定期患者为19例。

1.3 标本的分离与检测 将采集到的所有受试者的外周血(8 mL)进行离心(3 000 r/min，10 min)以分离血清，然后将分离出的血清置于-80℃冰箱中保存备用。血清HIF-1α、SENP1水平的检测使用酶联免疫吸附试验法，试剂盒均购自武汉基因美生物科技有限公司，按说明书进行操作。

1.4 肺功能检查 肺通气功能和弥散功能采用德国耶格 Master Screen Diffusion 型肺功能仪进行测定，测定指标为用力肺活量占预计值的百分比(FVC% pred)及一氧化碳弥散量占预计值的百分比 (DLco% pred)。

2 结果

2.1 两组肺功能指标比较 观察组患者肺功能指标(FVC% pred、DLco% pred)均显著低于对照组(P<0.01)。见表2。

表2 两组肺功能指标比较

2.2 两组血清HIF-1α、SENP1水平比较 观察组中血清HIF-1α、SENP1水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表 3。

表3 两组血清HIF-1α、SENP1蛋白表达水平比较

2.3 观察组血清HIF-1α与SENP1表达水平的相关性 观察组血清HIF-1α水平与 SENP1水平呈线性相关，血清HIF-1α水平随SENP1水平升高而升高，两者呈显著正相关(r=0.970，P=0.001)。见图1。

图1 IPF患者血清HIF-1α与SENP1的相关性

2.4 观察组血清HIF-1α与SENP1表达水平与肺功能指标的相关性 血清HIF-1α水平与FVC% pred(r=-0.878，P=0.001)、DLco% (r=-0.940，P=0.001)均呈显著负相关，血清SENP1水平与FVC% pred(r=-0.888，P=0.001)、DLco% (r=-0.953，P=0.001)呈显著负相关。见图2。

图2 IPF患者血清HIF-1α、SENP1与肺功能的相关性

2.5 稳定期和AEIPF患者血清中HIF-1α与SENP1表达水平比较 HIF-1α与SENP1在AEIPF组中的表达水平较IPF组中的表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 HIF-1α、SENP1在稳定期和急性加重期患者血清中表达水平比较

3 讨论

迄今，IPF发病机制尚不明确，临床诊断时患者往往已处于疾病晚期，因缺乏有效的治疗药物，近年来IPF的病死率并无明显缓解[12]。因此，深入解析其分子机制对寻找早期无创性血清标志物及寻求新的治疗靶点可提供有力的临床帮助。

HIF-1α是细胞适应低氧微环境的关键因子[13]。在常氧条件下，HIF-1α可被快速降解，以至于难以检测到HIF-1α的表达；在低氧条件下，HIF-1α可调控促红细胞生成素(EPO)、内皮素1(ET-1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-2及TGF-β1等多种靶基因的表达参与IPF进程[14-17]。所以，本研究认为HIF-1α可作为早期诊断IPF的生物标志物，以此为靶点可能是未来治疗IPF的新策略。已有的研究表明，HIF-1α存在SUMO化修饰，SUMU化修饰是十分重要的泛素化修饰，通过非氧依赖的方式，介导了HIF-1α的水解抑制其表达，而低氧状态下HIF-1α中的SUMU化修饰可被SENP1酶进行去泛素化，使SUMO化无法对HIF-1α进行降解[7,18-19]。因此本研究认为，SENP1催化的SUMO化修饰在IPF进展中扮演重要角色，以此为靶点可能改善HIF-1α对IPF的影响。为验证这一学术观点，首先基于临床样本观察到了在IPF患者血清中HIF-1α蛋白表达水平明显高于正常组，而SENP1表达水平也明显高于对照组，同时应用简单线性回归分析发现IPF患者血清HIF-1α水平随SENP1水平的升高而升高，Spearman 秩相关分析示两者呈显著正相关。这说明在IPF中SENP1抑制了SUMO化修饰对HIF-1α蛋白的水解，从而导致IPF患者血清中HIF-1α蛋白表达升高。这一实验结果为下述观察HIF-1α、SENP1是否与IPF病情相关奠定了理论基础。

IPF患者的主要表现是限制性肺通气功能障碍和弥散功能障碍，肺功能检测可以直接反映IPF患者的病情变化，也能间接反映其病理损伤程度[20]。但部分老年患者无法配合完成肺功能检查[21]。本研究结果显示，IPF患者血清 HIF-1α、SENP1水平与FVC% pred、DLco% pred 呈显著负相关，提示当肺功能检测难以进行时，可以依据HIF-1α、SENP1蛋白的表达水平对患者病情进行评估。

AEIPF的发生是IPF病情进展及死亡的主要事件[22]。AEIPF发生时，氧分压及细胞内的氧浓度明显下降，此时HIF-1α发生了精细化的调节，即SENP1催化的去SUMO化修饰占据主导，SUMO化修饰受到抑制，导致了HIF-1α大量产生，最终导致了IPF疾病的进展[23]。在本研究中发现AEIPF患者，HIF-1α、SENP1表达水平较稳定期患者明显升高。这一实验结果与基础研究的理论报道是一致的，也提示了SENP1催化的去SUMO化修饰影响了IPF的进展且与HIF-1α明显相关。

目前尽管具体机制未明，生物标志物检测有助于评估IPF患者的严重程度。同时IPF新药的临床试验也迫切需要可靠的生物指标来进行疗效评估。因此，有关生物标志物的研究日益得到重视。本研究虽然验证了SENP1抑制HIF-1α的SUMU化修饰与IPF临床特征有明显的相关性，但抑制SENP1表达后能否通过增加SUMO修饰而抑制HIF-1α的表达等机制方面的问题仍需进一步阐明。