人肺腺癌PD-L1的表达及与CD8+T淋巴细胞的相关性*

王婧华,杨宝军,张芳

平煤神马医疗集团总医院病理科(河南平顶山 467000)

肺癌属于一种起源于肺部支气管黏膜或者腺体的恶性肿瘤，患者多伴随着胸痛、喘鸣、咳嗽、咳血等临床症状[1]。近年来研究发现[2]，我国肺癌的发病率和病死率均较高，其中肺腺癌为肺癌的重要组成部分，其发病率呈现为逐步上升的趋势。但目前临床上对于肺腺癌的发生机制尚不完全明确，多采用手术、放化疗等手段进行治疗，但部分患者预后不良，5年生存率较低，因此寻找早期诊断肺腺癌的敏感指标对改善患者预后具有重要的意义。肿瘤细胞免疫逃逸是目前临床所研究的热点，其中程序性死亡因子配体1(PD-L1)与肿瘤免疫逃逸相关[3]。CD8+T属于T淋巴细胞亚群，参与机体免疫调节[4]。在本研究中，探讨人肺腺癌PD-L1与肿瘤中CD8+T淋巴细胞的相关性，为临床上肺腺癌的早期诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2018年1月至2019年12月收治的肺腺癌患者80例，男45例，女35例，年龄46～70岁，平均(56.2±10.2)岁，41例有吸烟史，分化程度：低分化29例，中/高分化51例，28例有淋巴结转移，TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期37例，Ⅲ+Ⅳ期43例。本研究患者及其家属均知情，签署知情通知书，并经过我院伦理委员会批准。纳入标准：经病理组织学诊断为肺腺癌，均未接受过放疗、化疗、免疫治疗。排除标准：合并其他肿瘤的患者；合并全身感染性疾病的患者；心、肾功能不全的患者；病历资料不全患者。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 取所有肺腺癌患者手术切除癌组织及癌旁组织标本，其中1/2组织标本采用40 g/L的多聚甲醛进行固定，并进行常规石蜡包埋，厚度为3 μm，连续切片作免疫组化标记。另外1/2标本使用机械分离加酶消化联合梯度离心法制备癌组织、癌旁组织单个核细胞悬液，待用。

1.2.2 PD-L1免疫组化检测 将石蜡切片在二甲苯中重复脱蜡处理10 min，行梯度酒精水化，将蛋白酶修复液加入在温度为37℃的恒温冰箱中行孵化处理，孵化处理30 min，去除抗原修复液，将所制备的切片转移至内含3% H2O2的湿盒中，密封(去过氧化物酶封闭液)，在温度为37℃的恒温冰箱中行孵化处理，孵化处理10 min，使用PBS清洗。清洗完成后将山羊血清加入，在室温下封闭处理，处理30 min，将封闭液吸处除(滤纸)，加入一抗，放入至适合后加入二抗，在室温下孵育处理，处理1 h，运用PBS清洗，行DAB显色处理10 min，采用梯度乙醇进行脱水，采用二甲苯冲洗片3次一直到透明，采用中性树脂封片处理，显微镜下观察免疫组化染色情况。每份标本在镜头下随机选择5个视野，所有病理切片均由2位以上经验丰富的医师采用双盲法进行确诊。

1.2.3 PD-L1蛋白表达量检测 采用Western blot法检测PD-L1表达。提取单个核细胞蛋白，BCA法定量分析，50 μg蛋白样品上样后做SDS-PAGE电泳处理，之后转至聚偏二氟乙烯膜，避光封闭1 h洗涤，将1∶1 000比例稀释的PD-L1一抗稀释溶液，4℃下过夜，洗涤，将1∶5 000比例稀释的PD-L1二抗稀释溶液加入，温床孵育1 h后洗涤，发光液ECL加入，曝光3次，取重叠值。分析蛋白条带灰度值。

1.2.4 CD8+T淋巴细胞含量检测 采用四色荧光流式细胞仪检测人肺腺癌组织和癌旁组织中CD8+T淋巴细胞含量，使用FCS Express V3流失分析软件分析数据。

2 结果

2.1 PD-L1、CD8+T淋巴细胞在人肺腺癌组织和癌旁组织中的表达比较 肺腺癌组织中PD-L1蛋白表达量、CD8+T淋巴细胞含量高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1和图1。

表1 PD-L1、CD8+T淋巴细胞在人肺腺癌组织和癌旁组织中的表达比较

注：A:癌旁组织；B:肺腺癌组织

2.2 PD-L1、CD8+T淋巴细胞与肺腺癌病理特征的关系 PD-L1蛋白表达量、CD8+T淋巴细胞含量在不同性别、年龄、吸烟史上对比，差异无统计学意义(P>0.05)。PD-L1蛋白表达量、CD8+T淋巴细胞含量在不同分化程度、TNM、有无淋巴结转移分期上对比，差异有统计学意义(P<0.05)。低分化、有淋巴结转移、Ⅲ+Ⅳ期肺腺癌组织中PD-L1蛋白表达量、CD8+T淋巴细胞含量高于中/高分化、无淋巴结转移、Ⅰ+Ⅱ，差异有统计学意义(P<0.05)。PD-L1、CD8+T淋巴细胞肺腺癌分化程度、有无淋巴结转移、TNM分期相关。见表2。

表2 PD-L1、CD8+T淋巴细胞与肺腺癌病理特征的关系

2.3 PD-L1、CD8+T淋巴细胞之间相关性分析 PD-L1、CD8+T淋巴细胞之间Pearson相关性分析，结果显示，PD-L1与CD8+T淋巴细胞水平呈正相关(r=0.344，P=0.002)。见图2。

图2 PD-L1、CD8+T淋巴细胞之间相关性

3 讨论

近年来，随着环境污染日益严重、吸烟人群的不断增加，我国肺癌的发病率、病死率呈现为逐年升高趋势，其中以肺腺癌类型为主[5]。在本研究中探讨人肺腺癌PD-L1与肿瘤中CD8+T淋巴细胞的相关性，为临床上肺腺癌的早期诊治提供参考。

程序性死亡因子1(PD-1)属于一种免疫细胞共抑制分子，为免疫球蛋白超家族成员，分子量为50～55 kD，在多种细胞表面上表达，包括NK细胞、活化B细胞、单核细胞、活化CD8+T细胞、活化CD4+T细胞、树突状细胞等，与自身免疫耐受性显著相关[6-7]。PD-L1为PD-1配体，属于一种负性共刺激分子，PD-L1位于9p24染色体中，对含有290个氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白产生编码作用[8-9]。当PD-1与PD-L1产生结合作用后，在受到抗原受体信号转导后，导致PD-1细胞质去中两个酪氨酸信号基序发生磷酸化，导致其效应T细胞凋亡或者失去其功能，最终实现肿瘤免疫逃逸[10]。临床研究发现[11]，PD-L1在多种细胞中广泛表达，分子量为40 kD，因其受CD274基因编码，在临床上又被成为CD274，具有负性调控免疫反应的作用。目前已有多数研究发现，PD-L1在肺癌中呈现为高表达，傅博等[12]在其研究中发现PD-L1在肺腺癌组织中低表达，且与患者放化疗预后相关；苏宁等[13]在其研究中证实PD-L1在肺腺癌组织中低表达，且与患者EGFR基因状态相关。在本研究中测定PD-L1在肺腺癌组织中的表达，结果发现，PD-L1在肺腺癌组织中高表达，且与分化程度、有无淋巴结转移、TNM分期相关。

CD8+为T淋巴细胞亚群之一，在细胞毒性T淋巴细胞上表达，参与机体细胞免疫反应，在抗肿瘤免疫反应中具有重要的意义[14-15]。有研究发现[16]，CD8+T淋巴细胞与多种细胞因子作用后可增强机体免疫功能，进而抑制恶性肿瘤进展。在肺癌组织中CD8+T淋巴细胞可促进IL-7大量产生，活化淋巴细胞因子所激活的杀伤细胞，从而发挥其肿瘤细胞杀伤功能，阻滞恶性肿瘤生长[17]。傅超等[18]研究发现，结直肠癌组织CD8+T淋巴细胞与患者预后相关。贡鸣等[19]在其研究中发现，包括肺癌在内的6种常见肿瘤患者在初始治疗时均存在CD8+T淋巴细胞高表达现象，且其研究发现，CD8+T淋巴细胞的升高与患者免疫系统激活，可刺激并分泌期效应细胞因子，进而产生较多的杀伤性淋巴细胞相关。在本研究中测定CD8+T淋巴细胞在肺腺癌组织中的表达，结果发现，CD8+T淋巴细胞在肺腺癌组织中高表达，且与分化程度、有无淋巴结转移、TNM分期相关。

临床研究发现[20]，当T细胞表面的PD-1与PD-L1相结合后，会招募蛋白酪氨酸磷酸酶1、蛋白酪氨酸磷酸酶2，作用于下游信号转导通路，产生阻滞信号，抑制CD4+T细胞增殖，促进CD8+T细胞增殖，进而发挥其抑制作用。在本研究中分析PD-L1、CD8+T淋巴细胞两者之间关系，结果发现，PD-L1、CD8+T淋巴细胞两者之间呈正相关，此结果说明，两者可能共同作用，参与肿瘤免疫逃逸。

综上所述，PD-L1、CD8+T淋巴细胞在肺腺癌组织中高表达，与患者疾病分化程度、有无淋巴结转移、TNM分期相关，且两者呈正相关，共同参与此病的发展。