靶向CysC基因shRNA慢病毒载体的构建对NSCLC A549细胞增殖的影响及机制初探*

郑大炜，郭娜

南阳市中心医院呼吸科(河南南阳 473009)

肺癌是全球发病率和病死率排名靠前的恶性肿瘤之一，我国更是肺癌患病大国，2014年全国肿瘤登记中心的数据显示我国肺癌发病率为35.23/10万，在全部恶性肿瘤发病中占19.59%；病死率为27.93/10万，在全部恶性肿瘤发病中占24.87%[1-2]。而非小细胞肺癌(non-small cell lung cance,NSCLC)在所有肺癌患者中高达85%，5年生存率低至15%[3]。究其原因发现，术后肿瘤复发和转移是影响NSCLC患者预后的重要原因[4]。研究显示，手术联合化疗在一定程度上可延长患者的生存时间，但也易对患者造成一定损伤影响其生活质量[5]。因此明确肺癌发病机制，寻找新的NSCLC治疗靶点和药物，为患者提供更好的诊疗手段，延长患者生命，提高生活质量，是目前甚至将来最主要的任务之一。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (Cystatin C,Cys C)是一种属于Cys Ⅱ家族的分泌型蛋白，又称CST3，可抑制包括半胱氨酸蛋白酶在内的多种蛋白水解酶活性，在炎性反应及肾癌、卵巢癌、结直肠癌等恶性肿瘤发生、发展中有一定影响[6-7]。但目前在NSCLC中的研究报道较少。2017年5月至2018年12月，本研究通过构建CysC-shRNA慢病毒载体，探讨CysC对NSCLC细胞增殖的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 NSCLC A549细胞、TOP10大肠杆菌感受态细胞和293T细胞购自中国科学生命院上海细胞研究所；RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和青霉素-链霉素溶液均购自美国Gibco公司；T4连接酶、限制性内切酶Age Ⅰ和EcoR Ⅰ及连接试剂盒均购自美国NEB公司；慢病毒载体Pglv2-U6-Puro及包装质粒购自上海吉玛基因化学有限公司；质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒及转染试剂盒Lipofectamine购自美国Invitrongen公司；qRT-PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；MTT购自美国Sigma公司；细胞总蛋白提取和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)试剂盒蛋白定量试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；兔抗人β-actin、PI3K和Akt单克隆抗体购自美国Abcam公司；二抗购自北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组 将A549细胞和TOP10大肠杆菌感受态细胞接种于RPMI-1640培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中，当细胞密度达到80%～90%时用胰酶进行消化传代。本研究共分为3组：CysC-shRNA组、Ctr-shRNA组和空白对照组，前者须将CysC-shRNA重组慢病毒转染A549细胞，中间须将Ctr-shRNA重组慢病毒转染A549细胞，后者无须任何处理。

1.2.2 构建CysC-shRNA重组慢病毒 根据GenBank中人CysC基因序列及shRNA设计原则合成CysC-shRNA序列：5′-GCTCCTGCTGGCCATCCTG-3′，同时设计并合成阴性对照序列Ctr-shRNA：5′-TGCGAACGACTTCTTCGCC-3′；将其与T4连接酶、限制性内切酶Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后慢病毒载体连接，后将其转化TOP10大肠杆菌感受态细胞，并将其接种于含青霉素-链霉素溶液的LB平板上继续培养16 h，挑取菌落进行测序，挑选序列正确克隆构建CysC-shRNA重组慢病毒和CysC-shRNA重组慢病毒，并将其转染293T细胞进行包装、浓缩及滴度测定，以上步骤均在上海吉玛基因化学有限公司帮助下完成。

1.2.3 重组慢病毒感染A549细胞 将CysC-shRNA和Ctr-shRNA重组慢病毒分别感染处于对数生长期的A549细胞，继续培养72 h，后在荧光倒置显微镜下观察各组GFP表达情况。

1.2.4 用qRT-PCR检测各组CysC mRNA水平 收集转染后处于对数生长期的各组单细胞悬液进行检测，参考总RNA提取和逆转录试剂盒操作说明书进行总RNA提取和cDNA合成，后采用qRT-PCR法检测各组CysC mRNA水平，其中CysC上下游引物分别为：5′-GCTCTTTCCAGATCTACGCT-3′和5′-AGGCAGCCGATGCTACTATT-3′；反应体系(20 μL)：cDNA产物1 μL、上下游引物各0.5 μL、SYBR Green Master mix液 10 μL和双蒸水8 μL；反应条件：95℃ 15 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s，共循环45次，内参基因是GAPDH，以2-ΔΔCT描述CysC mRNA相对表达水平。

1.2.5 MTT实验 转染后，调整各组细胞密度至1×104个/mL，并将其接种于96孔板上，每孔添加100 μL，并设置3个复孔，继续培养，并分别于第1、3和5天向每孔中避光加入20 μL 5 mg/mL MTT液，混匀，继续培养4 h，弃孔中废液，并向每孔加入100 μL DMSO液，摇床振荡 3 min，放酶标仪上检测 490 nm处各孔OD值，以OD值表示细胞增殖能力。

1.2.6 细胞克隆形成实验 转染后，调整各组细胞密度至1×104个/mL，并将其接种于6孔板上，每组设置3个复孔，继续培养，每隔2～3 d换液1次，并于倒置显微镜下观察细胞生长状况，培养10～12 d后，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，再用结晶紫染色15～25 min，待其自然干燥后观察细胞集落生长情况，并拍照。

1.2.7 Western blot实验 转染后，收集各组对数生长期细胞，参考总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，用BCA蛋白试剂盒进行蛋白定量分析，后进行Western blot实验：(1)按需要配置不同浓度分离胶和浓缩胶；(2)向槽中填满2×电泳缓冲液，平稳拔出梳子，按每孔50μg计算上样量，将不同体积蛋白及蛋白Marker依次加入孔内；(3)设置电流为 120 mA，通电1 h进行电泳；(4)在Marker标示下按不同蛋白大小切胶，再按滤纸-胶-PVDF膜-滤纸结构依次摆放，将蛋白恒流转至 PVDF膜；(5)加封闭液使其封闭；(6)向每条膜加入稀释后的β-actin、PI3K和Akt单克隆抗体，4℃过夜；(7)TBST洗膜；(8)再向每条膜上加入稀释好的二抗，37℃1 h，TBST洗膜；(9)ECL显影。

2 结果

2.1 荧光显微镜下观察转染效果 重组慢病毒感染A549细胞，72 h后于荧光显微镜下观察CysC-shRNA组和Ctr-shRNA组GFP表达情况(图1)，发现CysC-shRNA组GFP表达水平明显低于Ctr-shRNA组，提示重组慢病毒构建成功。

注：A:Ctr-shRNA组;B:CysC-shRNA组

2.2 重组慢病毒沉默效果鉴定 用qRT-PCR检测各组CysC mRNA水平评估沉默效果，CysC-shRNA组、Ctr-shRNA组和空白对照组CysC mRNA水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，CysC-shRNA组CysC mRNA水平明显低于Ctr-shRNA组和空白对照组(t=31.508、P=0.000,t=29.113、P=0.000)；提示沉默效果好。见表1。

表1 各组CysC mRNA水平比较

2.3 各组细胞增殖能力比较 从第1天开始，CysC-shRNA组、Ctr-shRNA组和空白对照组3组OD值比较差异有统计学意义(P<0.05)，以CysC-shRNA组细胞增殖能力最差，Ctr-shRNA组和空白对照组无明显差异。见表2。

表2 各组OD值比较

2.4 各组细胞集落形成能力比较 空白对照组、Ctr-shRNA组和CysC-shRNA组细胞集落形成个数分别为(83±16)个、(80±14)个和(15±3)个，CysC-shRNA组集落形成数量明显低于Ctr-shRNA组和空白对照组(P<0.05)，但Ctr-shRNA组和空白对照组比较则差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注：A:空白对照组;B:Ctr-shRNA组;C:CysC-shRNA组

2.5 各组PI3K和Akt蛋白含量比较 CysC-shRNA组PI3K和Akt蛋白明显低于Ctr-shRNA组和空白对照组，但后两组比较则差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 各组PI3K和Akt蛋白含量比较

3 讨论

以手术治疗为主、放化疗为辅的综合治疗方式是目前NSCLC的治疗方案，但多数患者易复发，且转移率较高，导致病死率居高不下，因此探讨NSCLC的具体发病机制对患者预后十分重要[8]。近年，国内外学者对肿瘤微环境研究较多，且发现其与肿瘤发生、发展及预后密切相关，而微环境中蛋白酶异常则是其主要特征之一，主要包括金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶三类，以利于肿瘤细胞进入血液或淋巴循环,并到达特异部位继续生存[9-10]。研究表明，在乳腺癌、头颈癌及肺癌等多数恶性肿瘤中存在蛋白酶高水平表达，导致肿瘤预后不良[11-12]。CysC则是一种重要的蛋白酶抑制剂，这是因为该蛋白C端有2个二硫键，可抑制半胱酸蛋白酶B、H及L等，保护细胞免受异常蛋白酶水解，同时参与调控细胞内外其他蛋白酶表达[13-14]。研究显示，半胱氨酸蛋白酶是CysC的主要底物，而半胱氨酸蛋白酶活性紊乱是肿瘤转化的重要特征之一[15]。研究发现，CysC在恶性肿瘤细胞中过表达，抑制死亡细胞释放蛋白酶导致不适当降解，调控组织蛋白活性，从而促进细胞增殖、转移及侵袭等[16-17]。Zhang等[18]和Ohara等[19]学者发现结直肠癌和肺癌中均存在CysC高表达，但均未涉及其具体作用。

shRNA是目前成熟RNA干扰技术之一，已在生物学和医学生物学等领域得到广泛运用。本研究基于上述CysC在肺癌中的异常高表达，采用shRNA和慢病毒重组的方式敲低CysC，从而探讨其对NSCLC的影响。本研究中荧光显微镜下GFP表达情况及CysCmRNA水平均提示CysC-shRNA和Ctr-shRNA设计良好，沉默效率较高，保证了后续实验结果的真实性。后续研究结果均提示敲低CysC可明显抑制NSCLC细胞增殖及集落形成能力，与Yan等[20]研究一致，即沉默CysC可在一定程度抑制食管癌细胞EC9706增殖。那CysC是如何发生作用的呢？本研究通过Western blot实验发现敲低CysC后，NSCLC细胞PI3K和Akt蛋白水平明显下降，提示下调CysC抑制NSCLC细胞增殖，与PI3K和Akt蛋白有关，PI3K和Akt是PI3K/Akt信号转导通路的关键因子。PI3K/Akt信号转导通路是PI3K/Akt信号转导通路的关键因子，是大部分细胞生长因子的下游通路，在肺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中表现活跃，帮助肿瘤细胞逃避免疫，促进增殖[21]。

综上认为，靶向下调CysC可明显抑制NSCLC细胞增殖，与PI3K/Akt信号通路相关。