lncRNA MEG3在2型糖尿病伴Hp感染患者血清中的表达及意义*

田艳娟,杨小东,刘成功

驻马店市中心医院全科医疗科(河南驻马店 463000)

2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)是以胰岛素抵抗所导致的高血糖为主要特征的慢性代谢性炎性疾病，其发病率呈增长趋势，成为继肿瘤、心血管疾病之后的第3位威胁人类健康的重大疾病[1]。研究[2]显示，炎症可引起胰岛素抵抗和胰岛β细胞凋亡，氧化应激可降低胰岛β细胞功能，导致T2DM的发生。幽门螺杆菌(helicobacter pylori，Hp)是一种革兰阴性弯曲杆菌，Hp感染可导致患者出现胰岛素抵抗、血脂氧化代谢紊乱以及氧化应激反应[3]。由于T2DM患者自身免疫系统紊乱，易感染Hp[4]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类小分子单链非编码RNA，在炎症反应和炎症性疾病中发挥重要作用[5]。lncRNA MEG3是近年来新发现的一种lnc RNA。研究[6-7]显示，lncRNA MEG3参与肺癌、胃癌等肿瘤的发生发展，可作为肿瘤治疗的分子靶点和预后判断生物标志物。但目前，lncRNA MEG3在T2DM伴Hp感染患者中的表达和意义还未知。本研究通过检测T2DM伴Hp感染患者血清中的表达水平，初步探讨其在该疾病中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年10月至2018年12月于本院就诊的132例T2DM患者为研究对象，诊断符合2013年中华医学会糖尿病学分会制定的中国糖尿病防治指南[8]，其中男59例，女73例。排除患有严重肾、肝及血管疾病的T2DM患者。经13C尿素呼气试验(13C-UBT，DOB>4为阳性，即感染Hp)检测Hp感染者83例(感染Hp组)，非感染者49例(非感染Hp组)。本研究经医院伦理委员会批准同意，患者自愿签署知情同意书。

1.2 血样采集和指标检测 采集所有受试者清晨空腹静脉血，3 500 r/min离心10 min，分离血清，-20℃保存备用。岛津8000全自动分析仪检测血清游离脂肪酸(FFA)水平，乳胶增强免疫(超敏)比浊法检测超敏C反应蛋白(hs-CRP)，酶联免疫吸附法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)、硫代巴比妥酸法检测血清丙二醛(MDA)水平，黄嘌呤氧化酶法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)，还原型谷胱甘肽消耗法检测血清谷胱甘肽还原酶(GSH-Px)，试剂盒(科研用)均购自南京建成生物工程研究所，所有样本检测时，均设置3个复孔，结果取平均值。

1.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测血清lncRNA MEG3表达水平 Trizol试剂提取血清中总RNA，使用微量核酸仪检测RNA在260 nm和280 nm处的吸光度值(A)，比值(A260nm/A280nm)处于1.8～2.0范围内说明RNA纯度较好，可用于后续检测。参照逆转录试剂盒将RNA合成为cDNA。以cDNA为模板，进行扩增，总体系20 μL。扩增条件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环。lncRNA MEG3上游5′-GCCTGCTGCCCATCTACAC-3′，下游5′-CCTCTTCATCCTTTGCC ATC-3′；GAPDH上游5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′，下游5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以3-磷酸甘油醛脱氢酶(lyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参，采用2-ΔΔCt法计算lncRNA MEG3的相对表达水平。

2 结果

2.1 T2DM伴Hp感染患者血清中lncRNA MEG3和FFA水平 与非感染Hp组比较，感染Hp组患者血清lncRNA MEG3水平显著降低(P<0.05)，FFA水平显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者血清lncRNA MEG3和FFA水平

2.2 T2DM伴Hp感染患者血清炎性因子表达水平 与非感染Hp组比较，感染Hp组患者血清TNF-α、IL-6和hs-CRP水平均显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者血清炎性因子表达水平

2.3 T2DM伴Hp感染患者血清氧化应激指标水平 与非感染Hp组比较，感染Hp组患者血清MDA水平显著升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px水平显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 两组患者血清氧化应激指标水平

2.4 T2DM伴Hp感染患者血清中lncRNA MEG3与FFA、炎性因子、氧化应激指标的相关性 Pearson相关性分析结果显示，T2DM伴Hp感染患者血清lncRNA MEG3水平与FFA、TNF-α、IL-6、hs-CRP和MDA呈负相关(P<0.05)，与SOD和 GSH-Px呈正相关(P<0.05)。见表4。

表4 血清lncRNA MEG3水平与FFA、炎性因子、氧化应激指标的相关性

2.5 影响T2DM患者感染Hp的Logistic多因素分析 Logistic多因素分析结果显示，lncRNA MEG3是影响T2DM患者感染Hp的独立因素(P<0.05)。见表5。

表5 Logistic多因素分析

3 讨论

MEG3基因位于染色质14q32.3，转录产物为lncRNA。近年来研究表明，lncRNA MEG3在与心血管疾病和炎症性疾病密切相关[9-10]。Zhou等[11]研究显示，lncRNA MEG3在冠状动脉疾病患者组织中表达降低，过表达lncRNA MEG3可通过靶向抑制miR-21表达降低血管内皮细胞的增殖。刘振峰等[12]研究显示，lncRNA MEG3在骨性关节炎软骨组织中表达降低，其可能通过调节血管生成在骨性关节炎的发生、发展中起重要作用。但目前，lncRNA MEG3在T2DM伴Hp感染患者中的表达和意义还鲜见相关报道。本研究选取共选取132例T2DM患者为研究对象，其中83例患者感染Hp，感染率为62.88%，与田利华等[13]报道的T2DM患者感染率60.34%的结果接近，说明多数T2DM患者易感染Hp。与未感染Hp患者比较，T2DM伴Hp感染患者血清中lncRNA MEG3表达降低，是T2DM患者感染Hp的独立影响因素，提示lncRNA MEG3可能参与T2DM感染Hp。

Hp是人类感染率最高的细菌之一，其可结合内皮细胞，刺激细胞表达黏附因子，且分泌细胞因子，导致白细胞黏附、聚集并损伤血管内皮，加剧局部炎症反应[14]。Hp还可引起全身性炎症反应升高，诱导局部动脉炎症，促进T2DM患者动脉粥样斑块的形成[15]。此外，Hp可产生脂多糖，诱导机体免疫反应，产生炎性细胞因子TNF-α、IL-6和hs-CRP。TNF-α具有多种生物学效应，与其他细胞因子形成复杂免疫网络，参与炎症反应[16]。IL-6在适量浓度对机体有利，而浓度过高时会产生一系列炎性损害。hs-CRP是感染的敏感性指标之一，可损伤内皮细胞功能，促进动脉粥样硬化进展[17]。本研究显示，T2DM伴Hp感染患者血清中hs-CRP、TNF-α和IL-6水平均显著高于未感染Hp的T2DM患者，与相关研究报道[18]结果一致，且hs-CRP是影响T2DM感染Hp的独立因素，说明Hp加剧了T2DM患者机体内炎性反应。Pearson相关性分析显示，T2DM伴Hp感染患者血清中lncRNA MEG3表达水平与hs-CRP、TNF-α和IL-6均呈负相关，提示lncRNA MEG3可能通过影响机体内炎症因子的表达参与T2DM感染Hp。

FFA又被称为非脂化脂肪酸，在正常机体血清中含量很少。研究[19]显示，FFA可通过抑制葡萄糖跨膜转运、促进胰岛细胞凋亡等引起胰岛素抵抗，在胰岛素抵抗疾病发病过程中起重要作用。此外，FFA具有较强的细胞毒性，能够损伤细胞膜、线粒体以及溶酶体等，引起机体内活性氧簇的增加，加剧机体氧化应激反应[20]。本研究显示，FFA在T2DM伴Hp感染患者血清中水平明显高于未感染Hp的T2DM患者，其lncRNA MEG3表达与FFA水平呈负相关，提示lncRNA MEG3可能在FFA加剧T2DM患者氧化应激中起调控作用。

氧化应激可损伤胰岛β细胞，引起胰岛素抵抗，促进T2DM及其并发症的发生、发展[21]。MDA是脂质过氧化产物之一，其水平高低可间接反映机体的氧化应激状态[22]。SOD是机体内的重要抗氧化酶，可清除氧自由基，降低对机体组织细胞的损伤，其活性高低反映机体的抗氧化能力[23]。GSH-Px也是一种抗氧化酶，与SOD具有协同作用。本研究显示，T2DM伴Hp感染患者血清中MDA含量升高，SOD和GSH-Px活力降低，与相关研究报道[24]结果一致，说明Hp感染可增强T2DM患者的氧化应激反应，提示对于T2DM伴Hp感染患者，应采取干预措施抑制Hp感染和氧化应激。本研究还显示，T2DM伴Hp感染患者血清lncRNA MEG3水平与MDA呈正相关，与SOD和GSH-Px呈负相关，提示lncRNA MEG3表达与T2DM伴Hp感染患者氧化应激密切相关，靶向促进lncRNA MEG3表达可能降低患者氧化应激水平。

综上所述，lncRNA MEG3在T2DM伴Hp感染患者血清中表达降低，其可能通过调节机体内脂肪酸水平、炎性因子表达及氧化应激水平参与T2DM感染Hp过程