Meis1 和Cyclin D3在子宫内膜癌中的表达及临床意义*

王茂彩,李骁,陈姗,陈勍

1中山大学附属第六医院妇科(广东广州 510065)；2中山大学孙逸仙纪念医院妇产科(广东广州 510042)

子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EMC)是一种最常见的女性生殖道恶性肿瘤。研究表明，子宫内膜癌的发生、发展与癌基因的激活和抑癌基因的失活有着一定的关系[1]。粒细胞嗜酸性白血病整合位点1(myeloid ecotropic leukemia integration site-1，Meis1)属于同源盒(homeodomain box，HOX)基因的三氨基酸环延伸家族(three amino acid length)，通过与HOX蛋白以及其他转录因子的相互作用而发挥其调节细胞活性的作用[2]。细胞周期蛋白D3(Cyclin D3)是细胞G1/S期的正性调控因子，有诱导细胞自主分裂，诱发癌变的作用，在子宫内膜癌、食管鳞癌、卵巢癌等多种癌中过表达[3-4]。既往在白血病相关研究中表明抑制meis1基因的转录，降低了Cyclin D3水平，阻止了细胞从G1期到S期的进程，说明Meis1的生长促进活性可能与细胞周期蛋白D-pRb细胞周期控制途径有关[5]。本研究拟联合检测Meis1与Cyclin D3在子宫内膜样腺癌组织中的蛋白表达情况，初步探讨在子宫内膜癌中的Meis1的表达是否异常，并与Cyclin D3的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2003年1月至2010年12月在中山大学孙逸仙纪念医院妇科住院治疗的45例子宫内膜癌患者的相关临床资料，均因“子宫内膜样腺癌”行根治性或姑息手术切除子宫。所有患者术前均未接受化疗、放疗及任何激素等治疗。患者年龄21～74岁，平均(54.0±9.4)岁。其中高分化腺癌19例，中分化腺癌14例，低分化癌12例，病理标本均经病理科医师复核确诊。并收集12例因其他良性病变切除子宫的患者的正常子宫内膜作为对照组。年龄30～49岁，平均(40.8±7.3)岁，无其他系统性疾病，近期未服用任何激素类药物。本研究已通过医院伦理委员会批准，所有入组患者或其家属均已签署书面知情同意书。整理和收集患者的相关临床资料信息，如患者年龄、孕产次、放化疗史、病理分型等。

1.2 方法

1.2.1 取材的方法 12例正常子宫内膜及45例子宫内膜癌患者的子宫内膜标本均来源于切除的子宫，子宫切除后，将子宫标本进行固定，并送石蜡病理。在病理结果证实子宫内膜腺癌的标本中，进行免疫组化检查。

1.2.2 免疫组化 采用非生物素二步法免疫组化染色。先用10%甲醛固定的子宫内膜标本，石蜡包埋后切片(4 μm)，继而脱蜡、酒精水化、修复抗原等；滴加Meis1多克隆抗体(1∶25,ABCAM company)或Cylin D3多克隆抗体(1∶50,奥博森)，予PV-6001(兔IgG抗体-HRP多聚体、中杉金桥)处理，冲洗，脱水、封片。取Cyclin D3及Meis1蛋白表达阳性的子宫内膜切片作为阳性对照，采用PBS(中杉金桥)代替一抗作为阴性对照。以腺上皮细胞中出现黄色至棕黄色颗粒为阳性。在光镜下计数400个细胞，采用双评分半定量法进行评价。阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分；显色度评分：细胞核无显色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。两项评分相加：0分为阴性(-)，1～2分为低表达(+)，3～4分为中表达(++)，5～6分为高表达(+++)。阳性表达率计算公式为：(中表达例数+高表达例数)/组例数×100%。

1.3 统计学方法 使用SPSS 26.0统计软件，对于率的比较采用2检验，如不符合四格表2检验的条件(T>5，且n>40)，应用Fihsher确切概率法。采用spearman相关分析Meis1、Cyclin D3在子宫内膜样腺癌中的阳性表达率之间的关系。采用Log-rank (Mantel-Cox) 分析Meis1和Cyclin D3表达与子宫内膜癌患者生存时间关系。

2 结果

2.1 Meis1在不同子宫内膜组织中的表达情况 Meis1在正常子宫内膜、子宫内膜样腺癌组织中均可呈现阳性表达，而且主要表达于细胞胞浆中，细胞排列紊乱，细胞核大，细胞核中未见明显表达，见图1。

12例正常子宫内膜组织中，1例Meis1为中表达，11例为阴性或低表达，阳性表达率为8.3%(1/12)。45例子宫内膜样腺癌组织中，18例Meis1为阳性表达(13例中表达、5例高表达)，阳性表达率为40%(18/45)，其中，高分化组、中分化组和低分化组中分别有52.6%(10/19)、42.9%(6/14)和16.7%(2/12)呈阳性表达。见图1，表1。

表1 Meis1在正常子宫内膜及子宫内膜样腺癌亚组之间的表达情况 例(%)

2.2 Cyclin D3在正常子宫内膜、子宫内膜癌中的阳性表达情况 Cyclin D3子宫内膜癌组织中主要在腺癌细胞中呈现阳性表达，位于胞浆中，呈淡黄或棕黄色，细胞排列不整齐，细胞浆肿胀，细胞核大，细胞核中呈阴性表达。见图2，表2～3。

12例正常子宫内膜组织中，4例Cyclin D3为阳性表达(2例为中表达，2例高表达)，阳性表达率为33.3%(4/12)。45例子宫内膜样腺癌患者的组织中，35例呈Cyclin D3阳性表达(24例为中表达，11例高表达)，阳性表达率为77.8%(35/45)。正常子宫内膜与子宫内膜样腺癌患者之间的表达差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 Cyclin D3在正常子宫内膜、子宫内膜样腺癌亚组中的表达 例(%)

2.3 Meis1与Cyclin D3在子宫内膜样腺癌组织中表达的相互关系 45例子宫内膜癌组织中，37.78%(17/45)Cyclin D3与Meis1均同时为阳性表达，Cyclin D3与Meis1均同时为阴性表达的20.00%(9/45)。在子宫内膜样腺癌组织中，Cyclin D3与Meis1的蛋白表达之间呈正相关(r=0.327,P<0.05)。见表3。

表3 Meis1与Cyclin D3在子宫内膜癌组织中表达的相互关系 例

2.4 Meis1与Cyclin D3表达与子宫内膜癌患者预后关系 45例内膜组织中，Meis1阳性表达患者(n=18)的平均生存时间为35.33个月，阴性表达患者(n=27)的平均生存时间为50.93个月，差异有统计学意义(2=11.22，P=0.000 8) 。Meis1阳性表达和阴性表达患者生存曲线见图3。45例内膜组织中，Cyclin D3阳性表达患者(n=35)的平均生存时间为43.89个月，阴性表达患者(n=27)的平均生存时间为47.5个月，差异有统计学意义(2=5.331，P=0.021 0) 。Cyclin D3阳性表达和阴性表达患者生存曲线见图4。

注：A:Meis1正常子宫内膜组织;B:子宫内膜腺癌组织(高分化组);C:子宫内膜腺癌组织(中分化组);D:子宫内膜腺癌组织(低分化组) (免疫组化，×200)

注：A:正常子宫内膜组织；B:子宫内膜腺癌组织(高分化组) ；C:子宫内膜腺癌组织(中分化组)；D:子宫内膜腺癌组织(低分化组)

图3 Meis1阳性表达和阴性表达患者生存曲线

图4 Cyclin D3阳性表达和阴性表达患者生存曲线

3 讨论

子宫内膜样腺癌是子宫内膜癌最常见的病理类型，其发病率逐年升高并有年轻化的趋势，对女性身体健康和生殖健康造成巨大威胁。子宫内膜癌与其他恶性肿瘤一样，本质是细胞生长周期调节失控，细胞呈无限制、自主增生和分裂，已知的影响子宫内膜癌细胞调控的相关基因主要包括PTEN、P27、P53、P16等，但具体机制尚不明确[1]。由于子宫内膜癌的早期筛查尚不成熟，分离和鉴定癌基因与抑癌基因对于子宫内膜癌的基因研究和早期筛查治疗都具有重要的意义。

Meis1基因广泛表达于多种正常造血组织中，如骨髓造血干细胞(HSCs)[6]，而同源框基因(HOX基因) 是一类控制胚胎发育和细胞分化的调节基因。在白血病中，HOXA9和MEIS1被认为是混合谱系白血病(MLL)融合的最关键目标，它们的共表达可快速诱导急性髓细胞白血病(AML)[7]。但是在前列腺癌研究中，MEIS1-HOXB13转录调控抑制前列腺癌增殖和转移[8]。在正常子宫内膜中meis1也有表达[9]。本研究观察到正常子宫内膜中meis1在基质细胞胞核中的表达强于腺上皮细胞，在腺上皮细胞胞核meis1阳性表达率为8.3%，明显低于子宫内膜样腺癌组(40%)(P<0.05)。初步说明meis的过表达可能是子宫内膜癌发生的一个因素。根据腺癌细胞分化级别进一步比较，虽然组间差异有统计学意义，但是两两比较差异无统计学意义。不排除样本量较少影响统计分析可能。

Cyclin D3是一种原癌基因，是细胞G1/S期的正调控因子，其参与并促进细胞自主分裂，诱发细胞癌变，与恶性肿瘤的发生、发展有着密切的关系[10]。临床研究表明，Cyclin D3在子宫内膜癌组织中呈现过表达[11]。本研究中子宫内膜腺癌中Cyclin D3的表达高于正常子宫内膜(77.8%vs33.3%,P<0.05)。根据腺癌分化级别分组后两两比较，高分化组、中风化组与正常子宫内膜组、低分化组间阳性表达差异有统计学意义。既往研究表明，不同亚型的细胞周期蛋白(cyclin D1[12]、cyclinA[13]、cyclin[14]等)均在子宫内膜癌中过表达，我们认为子宫内膜样腺癌细胞的无限增殖不是一种细胞周期蛋白过度表达的结果，而可能是多种细胞周期蛋白过表达异常的共同结果。

本研究结果显示，Meis1和CyclinD3在子宫内膜癌组织中的阳性表达率分别为40%(18/45)和77.8%(35/45)，而且有37.78%(17/45)的患者Cyclin D3与Meis1均同时为阳性表达，20%(9/45)的患者均同时为阴性表达。两者经配对2检验提示存在正相关(2=16.564，P<0.05)。进一步分析显示，Meis1和Cyclin D3阳性表达患者的平均生存时间明显低于阴性表达组患者，提示Meis1和Cyclin D3阳性表达的子宫内膜癌患者生存时间短，预后较差。既往白血病研究中，通过抑制meis1基因转录，可降低Cyclin D3水平，说明Meis1的生长促进活性可能通过调控与细胞周期蛋白D-pRb细胞周期有关[5]。Meis1可能通过促进cyclinD3的表达来共同参与子宫内膜样腺癌的增殖。