以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植*

徐婉欣, 凌玲, 查琴, 钟姝, 姚玲, 柯慧敏, 陈敬旺, 陈磊, 詹桃, 周文天

南昌大学附属眼科医院角膜屈光科(江西南昌 330006)

近十年的研究表明，干细胞是多能的、缓慢循环再生的细胞[1]。角膜缘干细胞(LSCs)位于角膜缘上皮基底层,具有不断增殖分化和向心性移动的能力[2- 3]。角膜缘干细胞给多种角膜缘干细胞缺乏或功能障碍引起的眼表疾病带来了新的希望，如Stevens-Johnson综合征、类天疱疮综合征、疱疹复合性疾病、眼的酸碱化学烧伤等，这些疾病可导致角膜结膜化、血管化、瘢痕化，最终视力大幅度下降，严重影响生活质量[4-5]。近年来，随着对角膜上皮干细胞生理的认识逐渐深入，角膜上皮干细胞移植研究取得了较大进展。自体角膜缘移植、异体角膜缘移植、体外培养的角膜上皮干细胞移植、口腔黏膜上皮细胞移植等已经成功应用于临床研究[6-8]。自体角膜上皮干细胞、口腔黏膜上皮干细胞是常用的细胞来源[9-11]。但是，自体角膜上皮干细胞来源少，且角膜上皮干细胞经体外扩增后，不利于直接手术用于临床上的角膜上皮干细胞移植。2017年11月至2019年12月，本研究拟利用以脱细胞角膜基质为载体的角膜缘干细胞体外扩增技术，制备可用于临床移植的含有角膜上皮干细胞的组织工程角膜，用于治疗因角膜上皮干细胞缺乏所致的角膜病患者。基于兔角膜与人角膜极其相似的特征，本研究用兔角膜缘干细胞来替代人角膜缘干细胞作为研究对象，以期为人角膜细胞的研究提供方法学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级雄性新西兰大白兔，体重2～2.5 kg，由南昌大学医学院动科部提供，裂隙灯显微镜检查眼前节未发现任何眼部疾患。

1.1.2 脱细胞猪角膜基质 深圳艾尼尔角膜工程有限公司研发的“艾欣瞳”生物工程角膜。

1.1.3 主要试剂及仪器 DMEM/F12混合液(Gibco公司)；青-链霉素混合液及PBS溶液(Solarbio公司)；胎牛血清(Gibco公司)；小鼠单克隆抗体角蛋白K3 (AE5、特异性识别K3)、驴抗小鼠二抗及山羊多克隆抗体P63(Abcam)；免疫组化试剂盒 (SABC)、DAB显色试剂盒(武汉博士德)；超净工作台、CO2培养箱(Thermo Scientific公司);光学倒置显微镜IX50型(Olympus 公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔角膜缘组织取材 雄兔2.5 kg，采用耳缘静脉空气栓塞处死后，碘伏消毒眼周，置入开睑器，PBS液冲洗结膜囊3次，无菌摘除眼球并剪除筋膜及眼肌，PBS反复冲洗后，浸泡于含双抗的PBS溶液中，放置在4℃冰箱中30 min，将浸泡过的眼球组织置于无菌平皿中，在超净工作台内操作，眼科镊固定眼球，眼科剪取下2 mm×2 mm×1 mm浅层灰白色交界区角膜缘组织，放置于含PBS的EP管中。

1.2.2 细胞培养液的制备 基本培养基为DMEM/F12混合液(Gibco公司)，每45 mL DMEM/F12混合液中加入7.5 mL胎牛血清(Gibco公司)、500 μL青-链霉素混合液(Solarbio公司，双抗液浓度为青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL)、2 mmol/L L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸(NEA)，重组人表皮细胞生长因子(rhEGF，10 ng/mL)。

1.2.3 组织工程化角膜上皮的制备 在超净工作台中取出干燥保存的脱细胞猪角膜基质6片，生理盐水复水，于DMEM/F12混合液中浸泡2 h，前弹力层面向上铺于6孔板孔底，干燥12 h，基质片与6孔板孔底紧密贴合后，取约1 mm×1 mm大小兔角膜缘组织贴附于基质片上，上皮面向下，3～4块/孔，干燥1 h，加2～3滴含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液，放入5% CO2、37℃培养箱中，次日适量加液，以后隔2～3 d换液，培养15 d，倒置显微镜下每天观察并记录细胞生长情况。

1.2.4 组织工程化角膜上皮的移植 取雄兔5只，采用水合氯醛耳缘静脉注射麻醉满意后，随机选择一眼为手术眼，碘伏消毒眼周，置开睑器，林格液冲洗结膜囊，用8 mm大小负压环钻于角膜中央钻取150 μm深度板层角膜，取下角膜直径8 mm、厚150 μm，板层刀修剪角膜植床，取培养14 d角膜上皮组织5片，用8.5 mm大小负压环钻钻切同等大小植片，上皮面向上，10-0缝线连续缝合于角膜植床上，3-0尼龙线间断缝合眼睑中央两针，术毕涂妥布霉素地塞米松眼膏，术后第2天拆除眼睑缝线点抗生素及激素类滴眼液，以后左氧氟沙星滴眼液4次/d，妥布霉素地塞米松滴眼液3次/d，妥布霉素地塞米松眼膏1次/晚，随访的临床检查包括裂孔灯检查以评估结膜充血、角膜光学清晰度、新生血管化和移植物退化等情况。

1.2.5 HE染色 取培养30 d后的组织工程化角膜组织1片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡，100%乙醇洗去二甲苯；梯度乙醇水化；苏木素、伊红染色各10 min；根据颜色深浅用80%的乙醇分化，梯度乙醇脱水；二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明10 min；在石蜡切片中央滴加中性树胶封片，显微镜下观察拍照。

1.2.6 免疫荧光化学染色 于组织工程角膜上皮移植术后30 d，采用空气栓塞的方法处死实验动物1只，取术眼角膜行免疫荧光化学染色；(1)60℃烤片12 h；(2)切片脱蜡：先将切片置于二甲苯中20 min，3次。然后依次置于100%、95%、85%和75%乙醇中，每级放置5 min。再用蒸馏水浸洗5 min；(3)热修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L 枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0),电炉或微波炉加热至沸腾后断电，连续煮23 min后，冷却23 min后拿出，冷却至室温。冷却后0.01 mol/L PBS(pH 7.2～7.6)洗涤3 min×3次；(4)切片置于硼氢化钠溶液中室温下30 min，水漂洗5 min；(5)切片置于苏丹黑染液中室温下5 min，水冲洗3 min；(6)血清封闭液室温封闭60 min；(7)孵育一抗：滴加适当稀释的一抗(HMGB1)，4℃过夜。PBS冲洗5 min×3次；(8)孵育二抗：滴加50～100 μL抗-兔-IgG标记荧光抗体，37℃孵育90 min，PBS冲洗5 min×3次；(9)DAPI工作液37℃染核10 min，PBS冲洗5 min×3次；(10)缓冲甘油封片;(11)避光保存，置荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 形态学观察

2.1.1 组织工程化角膜上皮 倒置显微镜下观察细胞状态，组织块接种第1周时进展缓慢，只有几个细胞出现在组织块周围，1周过后，细胞增殖状态增强，细胞呈“沙滩样”外观从组织块边缘延伸出来，7～9 d后，逐渐形成细胞生长晕(图1-A),10～12 d后，贴壁细胞达到70%～80%汇合，呈铺路石状(图1-B)，15 d后，贴壁细胞逐渐形成单层，细胞形状以多边形和梭形为主(图1-C)。

注：A：细胞生长7～9 d后，逐渐形成细胞生长晕(×4)；B：10～12 d后，贴壁细胞达到70%～80%汇合，呈铺路石状(×4)；C：15 d后，贴壁细胞逐渐形成单层，细胞形状以多边形和梭形为主(×10)

2.1.2 组织工程化角膜板层移植 手术完毕后，术眼角膜缝线规整，角膜边缘平滑(图2-A)；术后4 d对术眼进行裂隙灯显微镜拍照，植入眼的角膜稍浑浊，无新生血管，无严重结膜水肿和充血，荧光素染色钴蓝光下拍照显示角膜大部分着染(图2-B，图2-C)；术后9 d对术眼进行裂隙灯显微镜拍照，植入眼的角膜下方稍浑浊，未见新生血管，无严重结膜水肿和充血，荧光素染色钴蓝光下拍照显示角膜下方着染(图2-D，图2-E)；术后15 d对术眼进行裂隙灯显微镜拍照，角膜较前透明，没有新生血管，荧光素染色钴蓝光下拍照显示仅角膜缝线处着染，角膜4～5点位出现直径约2 mm圆形缺损(图2-F、2-G)；术后21 d对术眼进行裂隙灯显微镜拍照，植入眼的角膜透明，无新生血管，无结膜水肿和充血，角膜中央虹膜纹理清晰，荧光素染色钴蓝光下拍照显示角膜仅缝线处着染，下方圆形缺损消失(图2-H、2-I)。

2.2 HE染色 术后30 d HE染色光镜下可见植入后的角膜组织与宿主角膜组织结合良好，胶原纤维排列规则，上皮细胞可见4～5层结构，支架中见散在细胞，可见角膜缘干细胞多呈卵圆形，细胞核呈蓝色，大部分为单核，细胞质呈粉红色至深红色。见图3。

2.3 免疫荧光染色 术后30 d免疫荧光染色光镜下可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达，CK3单克隆抗体染色呈红色荧光，P63单克隆抗体染色呈绿色荧光，DAPI显示细胞核呈蓝色荧光。见图4。

3 讨论

国内外研究显示，角膜缘干细胞移植治疗角膜缘干细胞缺乏的动物实验中，可成功重建其眼表功能[12-13]。本实验应用脱细胞异种角膜基质为支架，角膜缘干细胞为种子细胞构建组织工程化角膜上皮为供体，行同种异体板层角膜移植，术后4～5 d植片雾状混浊，14～21 d左右植片透明。于术后1个月左右脱细胞猪角膜基质细胞化，HE染色显示植片和植床结合良好，上皮细胞可见4～5层结构，免疫荧光染色显示角膜上皮组织中AE5、P63抗体均有表达，证实了这种组织工程化角膜上皮适合作板层移植的供体。

干细胞具有多能性和增殖再生能力，是具有更新能力的未分化细胞[14-15]。众所周知，角膜干细胞位于角膜缘，在角膜上皮的基底层，角膜创伤愈合和更新都需要角膜缘干细胞的支持，Stevens-Johnson综合征、慢性角膜炎、酸碱烧伤等造成LSCD的眼表疾病，都需要通过角膜缘干细胞的移植来重建眼表功能[16]。体外培养角膜缘干细胞的重要条件是获得角膜缘组织。角膜缘处主要由基质层和上皮层组成，角膜缘干细胞不断增殖分化并向心性移动，成为角膜上皮细胞自我更新的源泉。目前研究表明，角膜缘干细胞的培养主要以组织块法和酶消化法两种培养方式为主[17]，酶消化法能把组织分散成单个细胞或细胞团，获得高比例的细胞群[18]，但其吹打、离心等操作方式繁杂，易破坏细胞，酶消化时间的长短也较难把控，时间长易损害细胞，时间短较难分离出细胞[19]；本研究采用的是组织块培养法，组织块培养法是目前使用最广泛的一种培养方式，其具有操作简便的优点，减少细胞污染的机会，且可以培养出具有体内生物学特性的细胞。

注：A：术后当天：术眼角膜缝线规整，角膜边缘平滑；B、C：术后4 d，无严重结膜水肿和充血，荧光素染色钴蓝光下拍照显示角膜大部分着染。D、E：术后9 d，植入眼的角膜下方稍浑浊，未见新生血管，无严重结膜水肿和充血，荧光素染色显示角膜下方着染；F、G：术后15 d，角膜较前透明，没有新生血管，荧光素染色仅角膜缝线处着染，4～5点位出现直径约2 mm圆形缺损。H、I：术后21 d，植入眼的角膜透明，角膜中央虹膜纹理清晰，荧光素染色钴蓝光下拍照显示角膜仅缝线处着染角膜是眼球的第一道屏障，易受眼内外各种有毒有害物质的影响[20-21]，基质前表面由4～5层上皮细胞组成的角膜上皮是角膜的第一防御屏障[22]，附于基质后表面的内皮由规则的内皮细胞层形成，并具有脱水泵功能，以保持角膜的透明度[23]。角膜基质是一种不可再生的组织，由约250～300层胶原层组成，由Ⅰ型胶原纤维组成[24]，它提供了角膜的大部分结构框架，约占角膜厚度的80%～90%，角膜基质中特殊的胶原网络决定了角膜的稳定性、机械强度和透明度[25-26]。因此，寻找一种具有良好生物相容性、高光学清晰度、抗手术韧性和组织工程角膜非免疫原性的理想支架是至关重要的。脱细胞猪角膜基质(APCM)具有良好的光学清晰度、耐手术韧性和生物相容性。此外，APCM还支持细胞分化、增殖和迁移[27]，APCM保存了天然角膜基质的三维结构，由Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白等主要分子组成，对细胞的分化、增殖和迁移非常重要[28]。到目前为止，还没有能够完全模仿天然角膜基质结构的人工支架。更重要的是，猪角膜有丰富的来源，比合成支架更容易获得。用APCM研制一种含有上皮和部分基质的前角膜替代物，来重建一个完整的、健康的、分层的上皮层来进行角膜移植以防御角膜感染是可行的。在本研究中，2～3层上皮细胞在APCM表面迅速形成，并在1个月内形成紧密连接。APCM保存了天然角膜的结构，包括能够支持基质细胞生长的孔隙和分子结构[28]。

注：角膜组织与宿主角膜组织结合良好，胶原纤维排列规则，上皮细胞可见4～5层结构，支架中见散在细胞，可见角膜缘干细胞多呈卵圆形，细胞核呈蓝色，大部分为单核，细胞质呈粉红色至深红色(A：×10；B：×20)

注：A：CK3单克隆抗体染色呈红色荧光；B：P63单克隆抗体染色呈绿色荧光；C：DAPI显示细胞核呈蓝色

角膜的生物力学性能是角膜组织工程的关键因素。用APCM构建的兔前角膜置换术具有抗缝线阻力等生物力学性能。在1个月的板层角膜移植期内，所有植入的角膜均无主要并发症，如基质水肿、新生血管形成或炎症等，植入角膜内无排斥反应或角膜扩张的症状。虽然在板层角膜移植早期，由于手术操作和紧固缝线造成角膜上皮缺损，但3周后正常角膜上皮迅速覆盖移植表面。因此，今后应采用一种改良的手术方法来改善这种情况。术后1个月，虽然角膜是透明的，但其表面似乎不规则，角膜有轻微的阴影，如果在临床上使用，可能会降低患者的视力。在天然角膜基质中，分布着静止的基质细胞，负责胶原纤维的调节和基质透明性的维持。它们也被命名为角化细胞[29]。然而，随着微环境的改变，如角膜损伤，会导致细胞凋亡或转化为成纤维细胞，从而使光线离散，产生角膜混浊，改变基质中的胶原成分[30]。为了保证上皮细胞和基质细胞在APCM中生长良好，采用血清进行培养，血清中含有复杂的生长因子，可将角化细胞转化成成纤维细胞或肌成纤维细胞[31]。这可能是移植角膜中不规则的角膜表面或薄雾形成的原因。因此，要完善培养体系，解决这一问题，如使用无血清培养系统。尽管需要改进培养系统和手术技术以获得最佳的视觉效果，但本研究中的结构是透明的，同时显示出良好的生物相容性、生物安全性和再生特性，使它们能够作为人类角膜移植的有价值的替代物。虽然临床上的研究还有待于进一步确定角膜替代物的全部潜能，以减轻供体角膜组织的缺乏，但我们的研究结果表明，当内皮细胞不受损害时，所构建的角膜替代物可能是LK或DLK等手术中替代人角膜组织的一种可能的选择。