PCA-决策树模型评价miR-30a与RPR、AAR、FIB-4、APRI在乙肝患者肝纤维化的应用价值

张明, 祝再然, 赵桂金, 董嘉良

天津市宁河区医院 1检验科， 2内分泌科(天津 301500)

乙型肝炎(hepatitis B，乙肝)在我国具有较高的发病率，是导致肝硬化和肝癌的原发性疾病，肝纤维化是其恶化的必经过程。动物实验[1]显示，及时有效的药物治疗能够逆转肝纤维化进程，从而恢复肝脏的正常组织结构。因此，乙肝患者肝纤维化的准确诊断和疾病严重程度的有效预测，对于抗纤维化的治疗、改善预后具有重要价值。肝脏活检是肝纤维化诊断的金标准，但有创、不能实时监测，难以满足动态监测需求[2]。目前，临床迫切需要快速、无创、准确且可重复的肝纤维化诊断指标，以便于疾病诊断、病情评估和抗纤维化的疗效评价。红细胞体积分布宽度与血小板比值(red cell volume distribution width-platelet ratio，RPR)模型、天冬氨酸/丙氨酸氨基转移酶比率(aspartate to alanine aminotransferase ratio,AAR)、FIB-4(Fibrosis-4)、天冬氨酸氨基转移酶/血小板比值指数(Aspartate aminotransferase/platelet ratio index，APRI)是国内外众多学者提出的肝纤维化无创诊断的代表性模型，诊断效能好，但仍缺乏精准性[3]。近年来研究显示，多指标联用有助于提高诊断的准确性。随着研究的深入，人们发现miRNA与肝纤维化有关。miR-30a能够通过逆转肝星状细胞活化来抑制腹膜和心肌纤维化进程，在肝纤维化患者中低表达[4]。本研究采用主成分分析(principal component analysis，PCA)-决策树模型评价miR-30a与RPR、AAR、FIB-4、APRI在乙肝患者肝纤维化的诊断和预测疾病严重程度中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院于2017年1月至2019年6月收治的875例肝病患者作为研究对象，男463例，女412例，年龄19～57岁，平均(38.5±6.5)岁，病程0.5～10年，平均(5.2±1.6)年，肝癌423例，肝良性病变(包括肝脏血管性疾病、代谢性疾病、病毒性肝炎、肝脏良性实质病变、酒精性肝病、肝脓肿和肝脏肉芽肿)293例，肝纤维化89例，胆结石70例。依据是否合并乙肝将患者分为乙肝组和非乙肝组，乙肝组226例，男120例，女106例，年龄19～57岁，平均(38.1±6.7)岁，病程0.5～10年，平均(5.1±1.5)年，肝癌140例，肝良性病变(包括肝脏血管性疾病、代谢性疾病、病毒性肝炎、肝脏良性实质病变、酒精性肝病、肝脓肿和肝脏肉芽肿)37例，肝纤维化39例，胆结石10例；非乙肝组649例，男343例，女306例，年龄19～57岁，平均(38.6±6.4)岁，病程0.5～10年，平均(5.3±1.6)年，肝癌283例，肝良性病变(包括肝脏血管性疾病、代谢性疾病、病毒性肝炎、肝脏良性实质病变、酒精性肝病、肝脓肿和肝脏肉芽肿)256例，肝纤维化50例，胆结石60例，两组性别、年龄、病程差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，两组疾病构成差异有统计学意义(2=58.223，P=0.000)。

1.2 纳入标准 (1)符合《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年修订)[5]和《中国肝病诊疗管理规范》[6]；(2)性别年龄不限；(3)肿瘤分级和分期不限；(4)无既往肿瘤病史；(5)自愿参与本研究，签署知情同意书，在知情同意的基础上进行肝脏活检；(6)本研究入选患者均获得伦理委员会批准。

1.3 排除标准 (1)肝脏活检失败，未明确病理诊断；(2)合并原发性肝癌、肝移植、自身免疫性肝病及遗传性肝病患者；(3)合并慢性阻塞性肺疾病、糖尿病、血液系统疾病、肾功能衰竭及其他恶性肿瘤者；(4)合并免疫缺陷病毒感染者；(5)入组前1周使用影响新陈代谢和凝血机制药物，或进行透析、使用血液制品患者，或1年内经抗病毒或抗纤维化治疗者；(6)合并严重心肺疾病。

1.4 方法

1.4.1 血清学指标测定 所有研究对象于肝穿刺前1周取空腹肘静脉血，3 000 r/min离心10 min，取上层血清，-40℃保存，检查血常规、血清生化指标和凝血酶原时间，测定血清miR-30a水平。血常规指标采用全血自动分析仪测定，凝血酶原时间采用血凝仪测定，血脂、肝肾指标采用全自动生化分析仪(型号：HITACHI 7600-020型)检测，透明质酸采用化学发光法检测，HBV血清标志物采用全自动化学发光免疫分析仪(型号：A RCHITECT i2000 SR)。所有检测由检验专业人员按说明书操作进行。

1.4.2 RPR、AAR、FIB-4、APRI计算 RPR=红细胞分布宽度/血小板；AAR=天冬氨酸转移酶/丙氨酸氨基转移酶；FIB-4=(年龄×天门冬氨酸氨基转移酶)/(血小板×丙氨酸氨基转移酶2)；APRI=天门冬氨酸氨基转移酶相对其正常上限值的倍数×100/血小板。

1.4.3 肝纤维化分级 超声引导下肝脏穿刺，取肝脏组织(≥15 mm)，10%甲醛溶液固定，常规石蜡切片，病理医生阅片，按Metavir病理组织学肝纤维化分级标准分为F0～F4级，F0级为无纤维化，F1级为无纤维间隔，汇管区纤维性扩大，F2级为有少数纤维间隔及汇管区纤维性扩大，F3级为无硬化结节，但有大量纤维间隔；F4级为肝硬化。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件，计数资料以率表示，采用2检验比较，计量资料以表示，采用t检验比较，ROC曲线评价诊断效能，相关性分析采用Spearman双变量相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组肝脏疾病患者RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a比较 肝癌、肝良性病变、肝纤维化、胆结石患者RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a比较差异有统计学意义(P<0.05)，组间两两比较，肝纤维化组RPR、FIB-4、APRI高于其余组(P<0.05)，AAR、miR-30a低于其余组(P<0.05)。见表1。

表1 4组肝脏疾病患者RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a比较

2.2 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a与肝脏疾病的相关性分析 miR-30a与肝癌、肝良性病变、肝纤维化和胆结石相关性有统计学意义(P<0.005)，其中与肝纤维化的相关性最高；AAR、RPR与肝癌、肝良性病变和肝纤维化相关性有统计学意义(P<0.005)，其中与肝纤维化的相关性最高；APRI、FIB-4与肝良性病变和肝纤维化相关性有统计学意义(P<0.005)，其中与肝纤维化的相关性最高。见表2。

表2 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a与肝脏疾病的相关性分析

2.3 乙肝纤维化组与非乙肝纤维化组RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a比较 乙肝纤维化组RPR、FIB-4、APRI高于非乙肝纤维化组，AAR、miR-30a低于非乙肝纤维化组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 乙肝纤维化组与非乙肝纤维化组各项指标比较

2.4 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a诊断乙肝纤维化的ROC曲线分析 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a诊断乙肝纤维化的ROC曲线下面积(AUC)>0.75，依次为miR-30a>RPR>AAR>APRI>FIB-4，诊断敏感度为71.7%～82.6%，特异度为72.0%～89.0%，诊断效果良好。见表4和图1。

表4 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a诊断乙肝纤维化的效果

图1 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a诊断乙肝纤维化的ROC曲线分析

2.5 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a与乙肝纤维化分级的相关性分析 乙肝纤维化分级与RPR、FIB-4、APRI呈正相关，与AAR、miR-30a呈负相关，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a与乙肝纤维化的相关性分析

2.6 RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a的PCA分析 以RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a五项指标提取主成分，按特征值>1提取第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)，PC1含的信息量最大，已含信息量不在出现PC2中。两者解释了原有数据72.1%的综合信息，主成分方程为：PC1=0.482miR-30a+0.412PRP+0.395AAR+0.127APRI+0.043FIB-4；PC2=-0.045miR-30a-0.027PRP-0.052AAR+0.548APRI+0.593FIB-4；PC1和PC2诊断乙肝纤维化的敏感度为71.8%、76.9%，特异度均为93.4%，AUC分别为0.722、0.731，表明两者诊断乙肝纤维化效果相当。

2.7 基于5项指标单项和联合的两种决策树模型比较 随机选取70.0%为训练集，剩余30%为检测集没建立单项指标决策树模型，单项指标中仅miR-30a进入决策树模型(2=45.034，P=0.000)；以PC1和PC2联合建立PCA-决策树模型，按两种模型对乙肝纤维化预测准确率进行比较，数据显示，单项决策树模型、PCA-决策树模型对乙肝纤维化的诊断准确度分别为85.3%、92.1%，预测准确度为88.5%、93.4%。

3 讨论

RPR、AAR、FIB-4、APRI是基于乙肝建立的乙肝纤维化诊断的无创模型，最新研究拓展了各模型在非酒精性脂肪性纤维化、丙肝性纤维化中的应用[7]。为进一步探讨各模型与乙肝纤维化的相关性，本研究纳入了胆结石、肝良性病变、肝癌等肝脏疾病，同时引入参与调节肝纤维化发展的miR-30a，采用PCA-决策树模型评价，以期提高乙肝纤维化的诊断和预测效能。

不同肝脏疾病患者各项指标比较显示，肝癌、肝良性病变、肝纤维化、胆结石患者RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a比较差异有统计学意义(P<0.05)，RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a与肝脏疾病存在相关性，其中与肝纤维化的相关性最佳。近年来部分文献[8]报道显示PRP诊断非乙肝性肝纤维化效能较好，与本研究结果大致吻合。miR-30a能够抑制腹膜纤维化和心肌纤维化的发生和发展，在肝癌和乙肝纤维化患者中低表达，因而呈负相关。

乙肝纤维化与非乙肝纤维化患者各项指标统计学分析显示，无创模型、miR-30a与乙肝纤维化密切相关，不同于其他肝脏疾病。各项指标在乙肝纤维化患者中异常，乙肝纤维化分级与RPR、FIB-4、APRI呈正相关，与AAR、miR-30a呈负相关，表明各指标与乙肝纤维化严重程度相关，能够反映患者病情。ROC曲线显示，各指标诊断乙肝纤维化的敏感度为71.7%～82.6%，特异度为72.0%～89.0%，AUC>0.75，诊断效果良好。各指标诊断的AUC依次为miR-30a>RPR>AAR>APRI>FIB-4，提示miR-30a、RPR诊断的效能优于其他指标。AAR、APRI、FIB-4是乙肝纤维化诊断的常规模型，具有中等敏感度和准确度，但不能完全替代肝脏活检。其中AAR模型用于乙肝纤维化分期评估存在争议，部分研究者认为可准确评估纤维化分期，部分研究者认为对严重肝纤维化基本无诊断价值[9]。RPR不同于其他模型，其选RDW而非酶类，RDW在乙肝纤维化患者中特异性异常，因而诊断乙肝纤维化的稳定性较好。据报道[10]，RDW每增加1%，纤维化发生的风险增高12.1%。研究[11]显示乙肝纤维化患者RPR高于非乙肝纤维化，本研究结果与之相符。亦有文献[12]显示，乙肝纤维化分级与RPR模型呈正相关，但缺乏精准性。总之，RPR与乙肝纤维化存在相关性，但尚未形成共识。miR-30a是具有调控功能的内源性小分子非编码RNA，从miRNA水平调节靶基因的表达，进而参与生命活动。研究发现，miR-30a在乙肝、肝硬化、肝良性疾病中差异化表达[13]，目前，miR-30a差异性表达已逐渐用于乙肝细纤维化的诊断[14]，有望成为新的诊断标志物。本研究中miR-30a诊断乙肝纤维化的AUC为0.892，诊断准确性较好。在单项决策树模型中，仅miR-30a进入模型，证实了miR-30a在乙肝纤维化诊断中的价值。

鉴于乙肝纤维化诊断指标RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a等较多，且各有局限性，因而临床建议联合多项指标，以提高诊断效能、疗效和复发预测。PCA-决策树分析时采用概率的原理将多个变量间的相互作用以树形图的方式呈现，并采用降维的方法对数据进行抽取构建的分类预测多参数模型，不影响数据的稳定性和准确性，具有直观、减少主观性等优点。该法在保留绝大部分数据信息的情况下提取几个指标代替原指标，将多指标归结为2～3个主成分，化繁为简，得到的结果也更加科学有效[15]。目前，PCA-决策树模型已用于胃癌的鉴别和诊断[16]。本研究应用PCA-决策树模型将RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a五个指标提取2个主成分，解释了原有数据72.1%的综合信息。随机选取70.0%为训练集，剩余30%为检测集建立PCA-决策树模型，结果显示PCA-决策树模型对乙肝纤维化的诊断和预测的准确度分别为92.1%、93.4%，表明PCA-决策树模型有助于乙肝纤维化的诊断。

综上所述，在乙肝纤维化的辅助诊断中，PCA-决策树模型结合RPR、AAR、FIB-4、APRI、miR-30a诊断乙肝纤维化效果理想。尽管如此，由于诊断误差和患者本身差异，乙肝纤维化的准确诊断仍较难。由于样本量有限，本研究尚未全面考察不同组合无创诊断模型对乙肝纤维化诊断和分期的价值，有待后续增大样本量深入研究。