孟鲁司特治疗儿童支气管哮喘急性发作期的疗效及对循环CD4+CD25+调节性T细胞表达的影响*

孙剑玥， 解玉， 徐亚娜

上海市普陀区中心医院(上海中医药大学附属普陀医院)儿科(上海 200062)

支气管哮喘属于过敏性疾病中常见且较为严重的一种，该疾病常见的临床表现为咳嗽、胸闷与发作性喘息，常伴各种并发症如呼吸衰竭、肺气肿等，甚至导致患者死亡[1]。研究证明该疾病主要与气道炎症、气道可逆性阻塞有关，其发病机制为白三烯与其他炎症介质共同作用于气道，导致患者出现气道高反应性、平滑肌痉挛、气道重塑等各种气道炎症等[2]。对于呼吸科医师来说，对气道重塑与气道炎症的预防十分困难。相关研究表示，在支气管哮喘的发病因素中，CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Tregs)的作用十分重要[3]，其可对免疫细胞的功能进行调节。当前对于孟鲁司特的研究主要集中于其在哮喘疾病中的抗炎作用，在其对CD4+CD25+Tregs的影响方面研究不足。因而本文主要研究孟鲁司特钠这一白三烯受体拮抗剂对Tregs及各种效应因子白细胞介素(IL)-5、γ干扰素(IFN-γ)水平的影响，对该药物治疗哮喘机制进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究方案经医院伦理委员会批准后，选取2016年3月至2017年6月于我院就诊的94例支气管哮喘急性发作期患儿为研究对象，其中患儿年龄为4～8岁，平均(6.64±1.36)岁；男44例，女50例；病程6～25 d，平均(22.34±9.07)d；既往喘息28例，既往过敏性疾病65例。

纳入标准：(1)以我国权威机构发布的《儿童支气管预防指南》为标准，所纳研究对象均需符合其中有关支气管哮喘的诊断指标[4]；(2)所有患儿在治疗前1个月未使用过糖皮质激素；(3)此前从未使用过白三烯拮抗剂；(4)患儿监护人均需签署相关知情同意书。

排除标准：对于合并其他重大疾病，如吸入性激素过敏、呼吸道或全身感染性疾病、严重全身性疾病、精神异常及其他重要脏器如心肝脾肺肾等疾病的患儿应排除在外。

按照随机数字表法将患儿分为对照组与观察组，每组47例。两组患儿的性别、年龄、病程等情况差异无统计学意义(P>0.05)，有可比性。见表1。

1.2 主要试剂与仪器 CD4-FITC、CD3-PC5、CD19-FITC、CD25-PE、CD23-PE单克隆抗体；IFN-γ检测试剂盒、IL-5(上海晶美生物工程公司)；肺功能机(美国伟康公司)；流式细胞仪、溶血制备仪(美国Beckman Coulter)；酶标仪、洗板机(美国DYNEX MRX)；酶标板(丹麦Nunc-immuno plate)。

表1两组患儿一般情况比较

项目例数性别(例)男女年龄(岁)病情严重程度(例)重度中度病程(d)对照组4721266.75±1.47321522.15±5.08观察组4723246.50±1.03331423.79±6.172/t值0.1710.9550.0501.407P值>0.05>0.05>0.05>0.05

1.3 方法

1.3.1 治疗方法 所有患儿入院后首先行常规检查，之后予其基础治疗，如解痉、吸氧、抗感染、化痰等，保证患儿饮食的清淡。在治疗用药上，对照组：给予布地奈德混悬液0.5 mg/2 mL雾化吸入治疗，1次/d，4周为1个疗程；观察组：在对照组用药的基础上，加服孟鲁司特咀嚼片5 mg，1片/d，4周为1个疗程。用药过程中定期为患儿进行体检，对其用药前后疾病症状的变化进行详细记录。

1.3.2 肺功能评价 使用肺功能机测量患儿的肺功能情况，主要包括以下指标：肺活量(FVC)、第1秒用力呼吸率(FEV1/FVC)、第1秒用力呼气量(FEV1)等。安排专人将肺功能机的操作步骤与原理演示给患儿家长，由家长进行测量。

1.3.3 血清IL-5、IFN-γ水平测定 分别于治疗前及治疗后3个月对患儿血清IFN-γ与IL-5的水平进行测量，选用的测量方法为酶联免疫吸附(ELISA)法。采集患儿血液标本，其采集的血液应为前臂的外周血，采集5 mL的血液以3 000 r/min的离心速度进行离心，时间为15 min，然后去其上清液，在温度为-80 ℃的温度下进行保存。患儿治疗前及治疗3个月随访时采集前臂外周血5 mL，将5 mL的抗凝血分成两份，分别标记标准品和样品，然后将100 μL的标品和50 μL的酶标记溶液加入到酶标记板中，将其反应90 min，反应温度为18～25 ℃，用洗扳机对其进行每次20 s的清洗，然后将50 μL的A、B底液加入到酶标板中，反应15 min，在避光且温度为18～25 ℃的条件下进行，最后加入50 μL的终止液停止其反应。使用5 mL抗凝血分别对样品及标准品进行标记，之后加入酶标记溶液50 μL于酶标板相应位置，再在此位置分别加入100 μL的样品与标准品，之后将酶标板放置在温度为18～25 ℃的环境中，反应时长为90 min，之后进行5次清洗，每次清洗需静置20 s，清洗之后于酶标板中分别加入底液A、B，每个单位50 μL，对其进行光密度(OD)的测量并依据OD值进行IFN-γ与IL-5水平的确定。

1.3.4 外周血CD4+CD25+Tregs百分比测定 患儿于治疗前与治疗后3个月分别采其前臂外周血5 mL，使用流式细胞仪对其血中CD4+CD25+Tregs的百分比进行测量。对血样进行离心，转速选择3 000 r/min，时间为15 min，然后提取上清液。对照组为小鼠抗体，观察组为使用多色荧光抗体标记的CD4、CD25，将两者进行混合，在温度为18～25 ℃的避光条件下，取抗凝全血100 μL，孵育15 min，然后Q-prep溶血制备仪对抗凝全血进行直接测定，在每份标本为5 000个细胞的情况下，计算出外周血CD4+CD25+Tregs的百分比。

1.3.5 日间、夜间症状评分 依据患儿日间与夜间哮喘症状表现的不同，评价症状程度得出分数[6]。夜间症状评分标准:(1)因哮喘持续发作无法睡眠记3分；(2)因哮喘症状发作经常憋醒记2分；(3)因哮喘症状憋醒1次记1分；(4)夜间无症状记0分。日间症状评分标准：(1)哮喘持续发作记3分；(2)频繁发作记2分；(3)哮喘症状较轻记1分；(4)无哮喘症状记0分。

1.4 统计学方法 选择 SPSS 20.0统计软件分析研究所得数据，用百分率表示计数资料，对其进行2检验；用表示计量资料，用t检验对其进行分析比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿治疗前后肺功能指标比较 相比于治疗前来说，治疗后两组患儿肺功能指标均改善明显，观察组变化程度更加明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2治疗前后肺功能指标比较

项目例数FEV1/FVC(%)FEV1(L)FVC(L)治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后对照组4761.3±12.562.8±13.21.5±0.61.5±0.51.9±0.52.1±0.4观察组4760.2±13.470.2±13.51.4±0.51.8±0.42.0±0.42.4±0.3t值0.4122.6870.8783.2121.0714.113P值>0.05<0.05>0.05<0.05>0.05<0.05

2.2 两组患儿治疗前后日间、夜间症状评分比较 与治疗前相比，治疗后两组患儿的日间与夜间的症状评分均下降显著，且观察组变化程度更大(P<0.05)。见表3。

表3 治疗前后夜间与日间症状评分比较 分

2.3 两组患儿治疗前后血清IFN-γ和IL-5水平比较 相比于治疗前，治疗后患儿的IFN-γ水平整体有升高趋势，而IL-5水平呈下降趋势，且与对照组相比，观察组变化显著(P<0.05)。见表4。

2.4 两组患儿治疗前后外周血CD4+CD25+Tregs比例比较 与治疗前相比，治疗后两组患儿外周血中CD4+CD25+Tregs百分比均有所升高，且观察组比对照组升高的程度更大(P<0.05)。见表5。

表4血清IL-5和IFN-γ治疗前后水平比较

项目例数IL-5(pmol/L)INF-γ(ng/L)治疗前治疗后治疗前治疗后对照组47307.49±87.60182.82±37.4815.43±1.7717.73±1.87观察组47305.69±91.82162.33±38.5515.38±1.8219.05±1.97t值0.0972.6130.1353.332P值>0.05<0.05>0.05<0.05

表5外周血中CD4+CD25+Tregs比例治疗前后比较

项目例数CD4+CD25+Tregs治疗前治疗后t值P值对照组479.49±2.3713.07±2.157.670<0.05观察组479.59±2.2914.09±1.9710.213<0.05t值0.2082.398P值>0.05<0.05

3 讨论

支气管哮喘这一炎性疾病的发生主要是由于炎症介质、细胞因子等物质对呼吸道刺激造成的，其支气管主要表现为气道重塑或支气管痉挛等，对患者的工作生活造成严重影响[5]。支气管哮喘的反复发作，气道发生纤维化和重塑，其主要原因是气道受到一些炎症介质如白三烯等的反复刺激。从分子生物学角度考虑，免疫紊乱可能是造成该疾病的重要原因[6-7]。相关研究[6]表明，引起哮喘疾病的内在机制可能是以辅助型T细胞2(Th2)为主的辅助型T细胞1(Th1)/Th2失衡、IFN-γ水平下降以及IL-5因子增多等。为解决当前常用药物不能根治哮喘的局面，研究人员不断探索如何使Th1/Th2的平衡保持稳定以及减少合成白三烯(LTs)，这可能为哮喘的治疗提供新方法。

CD4+CD25+Tregs于1995年被发现具有免疫抑制和免疫无能性的特征，主要作用机制是对机体的免疫平衡进行调节，这种细胞是一种抑制免疫调节的细胞是(由Sakaguchi等首次发现)。国内外研究[8-11]表明，在支气管哮喘的控制中，CD4+CD25+Tregs对其他免疫细胞活性的调节具有重要意义。CD4+CD25+Tregs可以对T细胞的增殖分化起到抑制作用，主要机制为这类细胞的表达产物作用于B7细胞后可以释放抑制因子作用于T细胞。同时其分泌的多种细胞因子具有抑制作用，具体如转化生长因子-β(TGF-β)、IL-10、IL-4等[12]，然而对于其作用的发挥是否是通过可溶性细胞因子来实现的，现今尚无明确说法。有研究[13]证实，支气管哮喘患儿急性发作期间体内CD4+CD25+Tregs的表达水平与患儿肺部的变化程度呈反比；同时其他研究[14]表示，哮喘的发生可能与CD4+CD25+Tregs的减少有关。本研究结果类似于其他研究[11-12]结论，即处于急性期的哮喘患儿外周血中CD4+CD25+Tregs水平明显增高，这表明造成支气管哮喘的原因可能为患儿免疫力的下降，这主要是由于其体内调节性T细胞的免疫功能失衡所致。

Th2作用于肺功能的机制为：分泌多种白细胞介素IL-13、IL-5、IL-4等活化嗜酸性粒细胞，从而导致气道高反应性、肺部炎症、黏液分泌等，甚至造成气道重塑等严重反应[14]。IFN-γ抑制炎症反应的机制为：调节炎症细胞，如Th17、B细胞、嗜酸粒细胞等的反应性，从而对其他炎症介质引起的过敏性炎症与气道高反应性起到抑制作用[15]。在Th1/Th2的平衡中，IL-5与IFN-γ的拮抗起到关键作用，本文通过研究证实了上述观点。

当前临床治疗急性支气管哮喘常用药物为吸入性糖皮质激素，具有较强的与糖皮质激素受体结合能力[16]，能够显著改善临床症状，然而并不能根治哮喘，这是由于激素不能阻止LTs的合成及其对呼吸道的作用，因而患者病情反复。与激素治疗相比，孟鲁司特这一新型药物的作用机制是选择性与患儿体内支气管平滑肌的白三烯受体相结合，且该药还具有依从性好、口感好等优点[17-19]。本研究结果显示，观察组患儿肺功能各项指标改善明显优于对照组，且日间夜间症状评分显著低于对照组(P<0.05)。证实孟鲁司特治疗儿童支气管哮喘急性发作期效果显著，不仅能够显著改善喘息等临床症状，还能提高其肺功能。同时，研究结果还显示，观察组患儿IFN-γ与IL-5水平变化等方面效果均优于对照组(P<0.05)，其原因主要为该药阻断了白三烯受体。这一结果表明孟鲁司特可以提高患者CD4+CD25+Tregs水平，从根本上治疗炎症。

综上所述，孟鲁司特通过选择性阻断LTs从而消除炎症反应，调高CD4+CD25+Tregs的比例，以及调节Th1/Th2的平衡，抑制T细胞的活性，从而有效的改善肺部功能，达到控制哮喘炎症的目的，因此，该项目药物可以广泛的应用于临床。