甲状腺乳头状癌组织FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达与其病情和预后关系分析*

曾海勇，吴恢升，吴妹，李海燕△，陈淑娟，刘雪婷，周丽明

深圳大学第一附属医院(深圳市第二人民医院) 1内分泌科，2甲乳外科，3高压氧科(广东深圳 518000)

甲状腺乳头状癌(PTC)是常见的内分泌恶性肿瘤之一，其发病机制较为复杂，且内分泌系良恶性肿瘤组织形态十分相似，单纯依靠常规组织学检查易造成漏诊、误诊等现象，严重影响患者的治病时机[1]。有研究显示[2-3]，PTC的发生受环境、遗传和激素变化或这些因素相互作用的影响，导致细胞周期调控异常而引发 DNA链结构改变，其中叉头框转录因子M1(FoxM1)、Ki-67、p27均与细胞周期的调控有关。同时也有研究显示，血管渗透因子(VEGF)与多种肿瘤的发生、发展密切相关。但有关上述因子联合评估PTC预后的研究报道较少[4]。对此，本研究通过检测PTC患者FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达，探讨其对PTC患者的预后分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年6月至2018年6月我院收治的PTC术后组织及其癌旁正常甲状腺组织80例，纳入标准：(1)经临床症状、病史、实验室等检查确诊为PTC[5]；(2)均未接受任何抗癌治疗；(3)无沟通障碍和精神病病史;(4)患者或其家属签署知情同意书。排除标准：(1)妊娠及哺乳特殊人群；(2)血液性疾病；(3)有心、肝、肾等严重性疾病；(4)拒不配合者。其中男31例，女49例，年龄22～65岁，平均(42.56±5.65)岁，临床分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期51例，Ⅲ期38例，Ⅳ期32例，肿瘤最大径1～5 cm，平均(2.32±0.45)cm。根据随访1年后是否死亡，分为生存患者52例，死亡患者28例。本次研究已经我院伦理委员会审批且通过，所有资料来源均真实可靠。

1.2 方法 所有患者经临床确诊为PTC并且均未进行放疗、化疗，采用免疫组织化学(SP)法检测所有患者的PTC组织及其癌旁正常甲状腺组织的FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达情况。方案如下：通过手术切除PTC组织及其癌旁正常甲状腺组织作为新鲜标本，所有标本经10%甲醛固定和石蜡包埋后，连续切片进行脱蜡，切片厚度均为4 μm，在60℃烤箱放置2 h，置于4℃冰箱保存，采用SP法检测同时对FoxM1、Ki-67、VEGF、p27染色，实验采用一抗鼠人FoxM1、Ki-67、VEGF、p27试剂，试验操作按照说明进行，DAB显色后用苏木素复染3 min，进行脱水待切片透明后用中性树胶封固，同时采用已知表达性的切片作为阳性对照，使用PBS缓冲液代替一抗性作为阴性对照，所有因子稀释比例为1∶50。所有试剂盒均购自广州锦物生物科技有限公司。

1.3 指标观察和标准[6]FoxM1、Ki-67、VEGF、p27阳性信号主要位于PTC的细胞核中，于病灶随机选择5个视野(×400倍)，观察癌细胞，根据SP法染色以细胞浆中出现变异性染色的深浅进行评分，阳性强度以无色为0分；淡黄色为1分；黄色为2分；棕黄色为3分。根据组织染色细胞所占总细胞数百分比评分：阳性细胞数<5%为阴性(0分)；5%～25%(1分)；26%～50%(2分)；51%～75%(3分)；>75%(4分)。两者评分相乘，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)，方便试验操作和分析，用(-)代表阴性，(+)(++)(+++)代表阳性，阳性代表高表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件，计数资料以例(%)表示，采用2检验，计量资料以表示，符合正态分布的采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同甲状腺组织的FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达比较 PTC组织FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达明显高于癌旁正常甲状腺组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

表1 不同甲状腺组织的FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达比较 例(%)

2.2 FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达与PTC临床特征的关系 单因素分析结果显示，FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达与临床分期、淋巴结转移、病理分级等有关(P<0.05)，见表2。

2.3 不同对象的FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达比较 随访1年后，发现死亡患者有28例，且死亡患者FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达明显高于生存患者，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

3 讨论

PTC是甲状腺癌中发病率最高的组织学类型，占头颈部肿瘤的首位，好发于女性群体，随着近年来生活节奏的加快和医学知识的匮乏导致该病发病率有明显上升的趋势，已成为当前社会的重大公共卫生问题。PTC临床无明显特异性症状，且预后良好，但若不及时治疗，可进一步出现淋巴转移等恶性症状，严重影响患者的健康生活。目前，手术切除是治疗PTC常见的治疗方法，可有效抑制肿瘤细胞生长，当仍有部分患者出现复发转移，甚至死亡的现象。故如何有效评估患者病情及预后发展，有利于挽救患者生命[7-8]。

有研究显示，PTC的发生、发展是一种典型的血管依赖性病变，而VEGF被认为是最重要的促血管生成蛋白，具有促进新生血管生成的作用，在PTC的发生、发展中密切相关[9]。同时有研究显示，细胞周期调控异常引发的DNA链结构改变是PTC的病因，其中FoxM1 属于Forkhead 的转录因子家族中的一员，具有调控肿瘤细胞增殖、凋亡及能量代谢的作用[10-11]。P27是CDKI家族中的一份子，能通过负性调控cyclin-CDK复合物来防止DNA异常复制的发生。Ki-67是目前较为肯定的与细胞分裂增殖相关的蛋白，与很多恶性肿瘤的发展、转归、预后均具有相关性[12]。

注：A：PTC组织FoxM1表达；B：PTC组织Ki-67表达；C：PTC组织VEGF表达;D：PTC组织p27表达

图1PTC中FoxM1、Ki-67、VEGF、p27的表达(SP，×400)

表2 FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达与PTC临床特征的关系 例(%)

表3 不同对象的FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达比较 例(%)

对此，本研究采用SP法检测PTC组织及癌旁正常甲状腺组织的FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达情况，结果发现PTC组织的FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达明显高于癌旁正常甲状腺组织，表明上述因子与PTC的发生、发展密切相关。而国内有学者[13-14]的研究也证实了上述因子在PTC的发展中会异常变化。这可能是机体遭受PTC细胞的侵袭时，癌细胞会破坏血管的正常生长，从而使血管内皮细胞增殖，诱导肿瘤血管生成，加剧VEGF的产生，且随着肿瘤血管的大量生成也会进一步催生癌细胞的增长，从而使Forkhead、Ki-67大量分泌，同时癌细胞的侵袭也会导致正常细胞的周期紊乱，继而导致DNA异常复制和多倍体的形成，从而影响p27的表达[15]。而本研究单因素分析结果显示，FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达与临床分期、淋巴结转移、病理分级等有关，表明上述因子的表达与PTC的病情发展密切相关，且进一步提示PTC患者的病情越严重，其表达水平越高。这可能是临床分期及病理分级越高的患者，其病情越严重，机体的肿瘤血管扩张较快，癌细胞的成长环境越好，其分裂及增殖的速度越快。因此，患者的病情越严重，FoxM1、Ki-67、VEGF等因子的表达越明显[16-17]。而患者发生淋巴结转移则意味肿瘤的发育可能进入晚期，此时的肿瘤细胞快速生长且向外扩散侵入淋巴血管，从而诱导新生淋巴管的形成，有利于肿瘤细胞脱落进入血管或向临近纤维蛋白和结缔组织基质扩散，最终导致大部分正常细胞由G1期到S期转化，使进入S期的瘤细胞增多，最终使其促进和参与DNA复制，加速细胞的恶性转化，继而加剧上述因子的分泌，由此可见FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达与PTC的发展可能存在某种关系[18-19]。此外，随访1年后，死亡患者FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达明显高于生存患者，表明上述因子可作为PTC的预后生存指标。这可能是VEGF的高度表达会提高肿瘤血管的生成，且有利于肿瘤细胞扩散，而FoxM1、Ki-67、p27的高度表达会破坏正常细胞的周期运行，加剧肿瘤细胞的增殖和分化，最终导致患者的病情恶化[20]。

综上所述，FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达与PTC的发生、发展有关，检测FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表达对评估患者病情发展及预后具有重要的价值。