通过生物信息学方法识别颈动脉粥样硬化斑块相关风险基因*

奈文青, 戴萌

南方医科大学南方医院健康管理科(广东广州 510515)

心脑血管疾病的发病率、病死率在全球均位居首位，动脉粥样硬化是引起心脑血管疾病发生的主要原因[1-2]。目前普遍认为动脉粥样硬化是一种慢性、炎症性、进展性疾病，而明确动脉粥样硬化的发病机制是防治心脑血管病的关键。尽管该领域存在大量研究，但是动脉粥样硬化进展和斑块破裂的分子机制目前仍不完全清楚，迫切需要新的研究来阐明斑块进展机制[3]。在生物技术层面，基因芯片发展非常迅速，目前使用也非常普遍，可以同时识别成千上万个差异基因，为动脉粥样硬化的发病机制研究提供新的方向。国内外大量研究通过基因芯片技术探寻动脉粥样硬化发生、发展的病理过程，旨在寻找动脉粥样硬化进展过程中的差异表达基因，识别动脉粥样硬化进展过程中的重要的信号通路和相关的致病基因，但是上述这些研究设计方面或多或少存在一些问题，如样本收集不规范、样本量过少、不同来源不同部位的血管进行比较，这些会引入一些试验偏差，影响研究结果的准确性和可推广性[4-7]。在本次研究中，为了克服不同个体、不同部位血管带来的研究偏差，我们采用相同个体的动脉粥样硬化斑块和对应的斑块旁组织进行基因芯片表达谱分析，获取斑块组织和斑块旁组织间差异表达基因，并运用系统生物信息学方法获取与动脉粥样硬化相关的信号通路和风险基因，初步探索动脉粥样硬化斑块形成的潜在分子病理机制。这些为深度挖掘动脉粥样硬化斑块发生机制、探寻动脉粥样斑块潜在治疗靶点和筛选心脑血管疾病早期预警靶标奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器 TRIGene提取RNA试剂,Takara公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit,RR047Q，Takara； SYBR® Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)-QPCR Kit，RR420A, Takara。蛋白质定量试剂盒(BCA法)，碧云天;RIPA裂解液，9806S,CST；鸡尾酒蛋白酶抑制剂，5872S，CST； SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)，P0051，碧云天；Western一抗二抗去除液(中性)，P0025N，碧云天；胎牛血清，Gibco；鼠抗VAV1单克隆抗体，Cell Signaling Technology,兔抗LYN单克隆抗体，Abcam，兔抗LYN单克隆抗体，Abcam, 兔抗PTPN6单克隆抗体，Abcam;GAPDH一抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、山羊抗鼠、兔抗山羊二抗、化学发光试剂盒均采购于Santa Cruz；本次实验研究所使用仪器主要有PCR仪Lightcycler96 (Roche Applied Science)和蛋白印迹扫描仪ChemiDocTMXRS Imaging System。

1.2 样本数据描述与处理 本次研究使用的GSE43292数据集来源于GENE EXPRESSION OMNIBUS数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/)，采用的芯片是Affymetrix Human Gene1.0 ST Array[8]。该芯片数据集样本： 32例颈动脉斑块组织和32例斑块旁组织，为颈动脉内膜剥脱术后的病变血管组织。术后切除的组织样本根据国际AHA的分类标准判定：斑块组织多是处于IV或V期，而斑块旁组织绝大多数为Ⅰ和Ⅱ期病变。

下载GSE43292的CEL原始文件后,然后对探针水平信号值进行系统预处理，包括：质控、变异稳定性的分析、背景的矫正、数据归一化处理和基因注释，最后转为基因水平表达值。斑块组织和斑块旁组织间差异基因采取SAM(significance analysis of microarrays)检验和倍比法(fold-change, FC)获取，筛选阈值为FDR≤0.05且FC>1.5或<0.667。采用R环境下的GO功能富集包[9]进行后续的GO功能注释，采用超几何检验，筛选阈值P<0.01。利用SubpathwayMiner[10]进行后续通路分析，采用超几何检验，筛选阈值P<0.01。通过Human Protein Reference (Release 9)数据库[11](http://www.hprd.org/)和Cytoscape[12-13](版本号3.6.1)实现蛋白网络构建及可视化。利用CFinder软件[14-15]在蛋白互作网络中筛查疾病风险模块。

1.3 提取RNA及检测其浓度和纯度 从超低温冰箱中取出8对颈动脉动脉斑块和斑块旁组织，Trizol法提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳判断RNA是否降解，最后用紫外分光光度法检测RNA的浓度和纯度，其中A260/280吸光值比率在1.8～2.1范围内者方可进行后续系列实验。

1.4 RT-PCR检测目标基因mRNA表达水平 反转录合成cDNA 反应依据反转录试剂盒说明书进行相应操作。采用SYBR 法Q-PCR 试剂盒(SYBR® Premix Ex Taq,Takara)在荧光定量PCR(Lightcycler96)上荧光定量PCR操作，实验条件：45 个循环包括95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，然后60～95 ℃融解曲线分析。目标基因引物的序列从引物数据库下载，并委托生工生物工程股份有限公司进行合成(表1)。内参基因采用GAPDH，并采用2-ΔΔCt方法[16]计算各基因对应的表达值。各个基因的表达值测量均重复3次。

1.5 组织标本蛋白表达水平分析 从-80℃实验室超低温冰箱中拿出4对颈动脉粥样斑块组织，称取重量后放入研钵，并用液氮研磨成粉末，用RIPA裂解液提取组织蛋白，测定蛋白浓度，按照标准制胶配方表来配制所需的5%和12%分离胶，并使用Bio-Rad微型电转移系统进行跑胶，参数采用恒流即32 mA(16 mA/gel)，时间约为70～90 min，转膜，转膜电压为恒压100 V，时间70 min，封闭及孵育抗体，在蛋白印迹扫描仪ChemiDocTM XRS Imaging System上扫描条带。并使用ImageJ软件测定条带的颜色深度，并用内参GAPDH进行标准化。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件，颈动脉粥样硬化斑块和斑块旁组织之间采用Wilcoxon符号秩检验对每个基因表达情况差异进行统计分析。统计检验水准为α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因表达谱芯片分析结果 通过颈动脉粥样硬化斑块的基因表达谱分析，我们获取了816 个差异基因，包括上调差异表达基因443个，下调差异表达基因373个(图1)。生物信息学分析中GO的富集结果：差异表达基因在细胞激活、细胞因子、适应性免疫应答和肌肉系统过程富集显著性是最高，上述生物过程可能参与了动脉粥样硬化斑块的进展。而通路的生物信息学分析结果：77个通路被差异上调基因显著富集，26个通路被差异下调基因显著富集。其中满足富集阈值要求的前5个显著性最高的通路如B细胞受体信号通路和转化生长因子-β(TGF-β)信号通路等(表2)。最后，我们构建了上述差异基因对应蛋白的互作网络，网络中的节点为差异基因和与差异基因直接互作的邻居基因。在该网络中，本研究共获取了10个在蛋白互作网络中具有密切互作联系的差异基因节点，说明这些节点在网络中与其他节点具有更紧密的互作关系，在生物网络中占据更重要的位置，提示在疾病进展中可能发挥着更重要作用。这些密切互作的节点基因包括SMAD9、LYN、PTPN6、ZBTB16、SYK、PRKCB、SVIL、VAV1、BMPR1B 和 BTK(图2-A)。此外，在蛋白互作网络中使用CFinder软件寻找疾病风险模块。图2-B显示在默认参数下识别到的疾病风险模块，这个模块中包括8个差异表达的基因，分别是CSF2RB、LCP2、LYN、PLCG2、PTPN6、PTPRC、SYK和VAV1。结合蛋白互作网络中的前10个重要的差异基因节点和疾病风险模块中的差异基因，我们发现SYK、LYN、PTPN6和VAV1无论在蛋白互作网络还是疾病风险模块中都占据关键的位置，即为联合分析的重要差异基因，可能是疾病发生、发展中发挥重要作用的基因。

注：红色圆点代表上调差异基因共443个，差异程度最大的基因为FABP4，蓝色圆点代表下调差异基因373个，差异程度最大的基因为CNTN1。Atheroma plaque:颈动脉粥样硬化斑块组织，Macroscopically intact plaque：斑块旁组织

图1动脉粥样硬化斑块和斑块旁组织间差异表达基因火山图

2.2 实验验证关键的差异基因 所有实验均重复3次。采用荧光定量PCR对8对颈动脉斑块(n=8)和斑块旁标本(n=8)进行分析，验证上述标本中SYK,LYN,PTPN6和VAV1基因的表达改变：VAV1(13.2±4.7), LYN(3.6±0.9), SYK(12.1±4.4)和PTPN6(11.8±4.6)。结果显示，4个差异表达基因在mRNA表达层面与芯片分析结果趋势完全一致，且差异表达程度较芯片更明显(图3)。

表1 实时荧光定量PCR引物

表2 差异表达基因富集KEGG排名前5的通路结果

使用蛋白免疫印迹分析4对颈动脉粥样斑块(n=4)和斑块旁组织(n=4)，结果显在斑块组织中LYN,SYK和PTPN6的蛋白表达水平显著增加：LYN(2.2±0.3)、SYK(26.3±5.3)和PTPN6(1.8±0.2)，与基因芯片检测趋势相符。但是VAV1在蛋白印迹条带上并未检测出来。

3 讨论

本研究运用基因芯片技术对颈动脉斑块组织和斑块旁组织进行分析，芯片分析结果显示有816个差异表达基因，其中上调基因443个，下调基因373个，上述差异基因可能参与与斑块的发生、发展。生物信息学分析结果：动脉粥样硬化发生、发展可能与免疫应答、炎症、NK细胞介导的细胞毒作用和FcεRI信号通路等有关。而进一步的蛋白互作网络与风险模块联合分析提示：VAV1,SYK,LYN和PTPN6可能在动脉粥样斑块进展中发挥着重要作用。

前期已有一些研究表明SYK和VAV1在动脉粥样斑块过程中发挥重要作用。SYK通过激活单核细胞趋化蛋白-1参与动脉粥样硬化进展[17]。SYK抑制剂BAY61-3606可以显著抑制血管平滑肌细胞的病理增值和迁移，提示SYK可能是动脉粥样硬化的潜在治疗靶点[18]。Choi等[19]发现TLR4/SYK介导的巨噬细胞应答促进动脉粥样斑块中慢性炎症的发生发展。体外实验显示在血管平滑肌细胞中激活的SYK通过释放IL-1β促进动脉粥样斑块中炎症的进展和微钙化形成[20]。另一项研究也显示，SYK抑制剂fostamatinib可以削弱小鼠体内斑块的进展，提示SYK可能是动脉粥样硬化进展的潜在抗炎治疗靶点[21]。

VAV1仅表达于血液细胞，作为鸟嘌呤核苷酸交换因子参与RAC1和Rho GTP酶的信号转导。VAV1参与的生物学过程与动脉粥样硬化发生、发展密切相关，如NADPH氧化酶介导活性氧产生、细胞死亡和白细胞激活[22]。Rahaman等[23]发现在辅以高脂饮食条件下，apoE-/-/vav1-/-小鼠较apoE-/-小鼠主动脉血管动脉粥样斑块面积显著减少，免疫组化结果提示apoE-/-/vav1-/-小鼠较apoE-/-小鼠斑块组织中巨噬细胞和皂泡细胞数量减少，提示Vav1与动脉粥样斑块发生、发展相关。敲除Vav1基因只是适度抑制氧化低密度脂蛋白的吸收和皂泡细胞的形成，同时敲除Vav1和Vav3基本完全抑制该病理过程，Vav家族在动脉粥样斑块形成中可能发挥重要的调节作用，作为新型潜在治疗靶点值得期待[24]。在我们此次研究中，VAV1在颈动脉粥样斑块组织中的免疫印迹实验中未能检测到，更换VAV1抗体后仍未能检测到，虽然在基因芯片和qPCR中可以检测到其mRNA的表达，考虑VAV1在蛋白翻译层面可能被阻断，从而表达量过低引起无法检测到相关数值。

LYN编码酪氨酸蛋白激酶参与肥大细胞脱颗粒。LYN属于Src家族激酶，参与调节糖蛋白Ⅵ信号，其缺失会导致血小板激活延迟和凝聚障碍[25]。体外实验证实，在巨噬细胞中oxLDL通过激活Lyn从而促使CD36募集并激活Na+/K+-ATPase-Lyn复合物，促使巨噬细胞摄入oxLDL和皂泡细胞形成[26]。Miki等[27]研究揭示Lyn在血脂代谢中发挥重要作用，通过诱导单核细胞趋化蛋白1表达可能参与动脉粥样硬化斑块的发生、发展。我们此次研究发现LYN在动脉粥样硬化斑块组织中mRNA和蛋白水平都是增加的，提示LYN可能促进动脉粥样斑块的发生、发展。

注：A、B：节点代表基因编码的蛋白，节点间的边代表蛋白间的互作关系，红色节点代表上调差异基因编码的蛋白，蓝色节点代表下调差异基因编码的蛋白，粉色节点代表非差异基因编码的蛋白，但是与差异基因编码蛋白之间存在直接互作关系。B：在上述蛋白互作构建的网络中通过CFinder软件发现的疾病风险模块

图2差异表达基因蛋白互作网络构建和疾病相关风险模块联合分析

注：ATH:颈动脉粥样硬化斑块；MIT:斑块旁组织；A：通过qRT-PCR在8对颈动脉粥样斑块和斑块旁组织中验证VAV1、LYN、SYK和PTPN6表达情况，**与MIT比较P<0.01；B：在4对颈动脉斑块组织和斑块旁组织中蛋白的表达情况，并使用ImageJ软件进行灰度值分析

图3通过手术标本验证基因芯片分析的4个差异表达基因

PTPN6是蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员，作为信号分子参与调控细胞生长、分化、细胞周期和肿瘤转化[28]。PTPN6除参与肿瘤的发生、发展外，还参与气道炎症反应和血糖稳态的调节[29-30]。本研究显示PTPN6在动脉粥样斑块组织mRNA和蛋白水平都是表达增加的，首次表明PTPN6可能参与动脉粥样硬化发生、发展，其功能研究将是我们后续研究的重点。

综上所述，本次研究通过系统生物信息学方法研究动脉粥样硬化斑块发生、发展过程中基因的表达变化，对全面、综合、系统化的认识动脉粥样硬化斑块发生、发展奠定一定的基础，为颈动脉斑块发生机制研究提供了一些新的方向和思路。本次研究发现了VAV1,SYK,LYN和PTPN6可能与动脉粥样硬化斑块形成相关，并实验验证了上述基因的表达变化，而PTPN6可能是参与动脉粥样硬化斑块发生、发展的关键基因，其功能研究有待进一步分析。