菌酶协同作用制备鲢鱼鲜味剂分析

◎ 任 涛，余 薇，罗 茜，刘 婷，潘笃杰

（武汉工控工业技术研究院有限公司，湖北 武汉 430019）

水产品味道鲜美，因其不但具有高蛋白、高度不饱和脂肪酸、微量元素和维生素等营养成分，而且还具有游离氨基酸、牛磺酸、琥珀酸、核苷酸、肌肽、鹅肌肽、甜菜碱及氧化三甲胺等具有特殊风味的呈味物质[1]。

生物体组织细胞中存在着各种消化酶，在控制条件下，它们能对细胞内蛋白质、多糖、脂肪等大分子进行分解，尤其是这种多酶自溶体系通过激活可以将蛋白质分解为氨基酸和肽类，从而改变原料的物理化学结构和营养成分组成，进一步影响其风味和质构[2-7]。米曲霉能够分泌多种水解酶系，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶等，广泛应用于发酵食品工艺中。耐盐酵母，也被称为“营养酵母”，具有繁殖快、酶系丰富、不产毒素等优点[8-9]。

本文在对当前控制酶解及自然发酵制备鲜味剂工艺研究的基础上，以鲢鱼为原料，利用鱼体内源酶系对原料进行预水解，通过米曲霉和耐盐酵母共发酵过程分泌的酶系催化原料成分，多级转化制备水产鲜味剂，对制备的鲢鱼鲜味剂理化和感官指标进行了定性、定量分析，以期能够为水产品综合深加工提供一条新途径，对调味品行业新产品开发提供参考，为该产品的工业化应用提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米曲霉、耐盐酵母，湖北省工业微生物菌种保藏与研究中心筛选保藏；鲢鱼、香菇柄、食盐，市售；其他试剂均为分析纯。

PL2002型电子分析天平，梅特勒—托利多仪器上海有限公司；PHS-25型实验室pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；WEF.M6/16马弗炉，沃尔福（上海）实业有限公司；胶体磨，天水骨泥机厂；DV-C粘度计，Brookfield公司；SPME萃取装置：SPME手柄；萃取头；气质联用仪：7890A/5975C（Agilent）；顶空采样瓶：20 mL（Agilent）；氨基酸自动分析仪，日立 L8800；等离子体发射光谱仪，热电iCAP6300；原子吸收光谱仪，日立Z5000；自动蛋白质分析仪，热电FLASH 4000 N；发酵罐，NBS。

1.2 实验方法

1.2.1 菌酶协同作用制备鲢鱼鲜味剂的工艺条件

（1）原料准备。鲜活白鲢鱼三去（去头、去腮、去内脏）后清洗干净，超低温粉碎成鱼糜冷藏待用。香菇柄烘干后，超微粉碎至60～80目待用。定量分析鱼糜水分、蛋白质、脂肪、灰分和挥发性风味成分。

（2）内源酶预酶解。冷藏的鱼糜用0.5 mol·L-1NaOH调节pH值至9.0，55 ℃酶解1 h，监测内源酶处理过程中体系总挥发性盐基氮（Total Volatile Basic-Nitrogen，TVB-N）、游离氨基态氮、黏度的变化。

（3）发酵。调整酶解液中香菇柄粉含量为20%，NaCl含量2%，115 ℃灭菌10 min。将扩培后的混合菌株（米曲霉∶耐盐酵母=1∶2）接种到发酵培养基中，调节pH和发酵温度，间歇搅拌培养。基本发酵参数：混菌接种量3%，pH值为6.0，温度32 ℃，共发酵120 h。

（4）自溶。调整发酵液NaCl含量至5%，温度60 ℃以促进菌体裂解释放胞内核苷酸、谷胱甘肽、B族维生素等多种成分。

（5）灭菌并低度热反应。自溶后的反应液升温至105 ℃并维持10 min。在此过程中原料中各种代谢产物之间发生轻度美拉德反应，使得产品质地均一、香味柔和本真。定量分析产品营养成分、挥发性成分、氨基酸组成、重金属含量和卫生指标。

1.2.2 检测方法水分的测定根据《食品安全国家标准 食品中水分的测定》（GB 5009.3—2016）；灰分的测定根据《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》（GB 5009.4—2016）；蛋白质含量测定根据《食品安全国家标准 食品中蛋白

质的测定》（GB 5009.5—2016）；脂肪含量测定根据《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》（GB 5009.6—2016）；氨基酸态氮含量测定根据《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》（GB 5009.235—2016）；砷含量的测定根据《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》（GB 5009.11—2014）；铅含量的测定根据《食品安全国家标准 食品中铅的测定》（GB 5009.12—2017）；镉含量的测定根据《食品安全国家标准 食品中镉的测定》（GB 5009.15—2014）；汞含量的测定根据《食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定》（GB 5009.17—2021）；挥发性盐基氮的测定的测定根据《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》（GB 5009.228—2016）；氨基酸组成分析参照《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》（GB 5009.124—2016）；呈味核苷酸二钠测定参照《鸡精调味品》（SB/T 10371—2003）；微生物检测：GB4789系列；挥发性成分分析：固相微萃取（Solid Phase Micro-Extraction，SPME）结合气质联用仪（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）。

2 结果与分析

2.1 内源酶酶解前后鱼糜TVB-N和氨基酸态氮含量的对比分析

初始鲢鱼的TVB-N值为14.25 mg/100 g，氨基酸态氮含量为18.5 mg/100 g，黏度为5 156 cp，3 h时内源酶水解液的TVB-N值为27.7 mg/100 g，黏度为418 cp，此时氨基酸态氮含量为131.3 mg/100 g。进一步延长内源酶解时间，游离氨基酸态氮含量无显著变化，而TVB-N值逐渐升高，这是因为随着内源酶活性降低，来自原料及开放体系的腐败菌快速增殖，分解蛋白质生成氨、二甲胺、三甲胺等挥发性含氮化合物。这些成分的存在会严重影响水解液的感官特性，因此控制内源酶水解过程的TVB-N值低于30 mg/100 g。此外内源酶水解会显著降低反应体系的黏度，有利于增强设备利用率和降低工序能耗便于工业化生产。

2.2 原料及产品营养成分分析

通过表1和表2可以看出，鲢鱼经内源酶预酶解、发酵、自溶、灭菌并低度热反应处理后得到的鲜味剂产品蛋白质含量高，脂肪及氯化物含量低，总氨基酸含量在18.82%。氨基酸种类齐全，必需氨基酸含量占氨基酸总含量的36.2%，必需氨基酸含量与非必需氨基酸含量之比（EAA/NEAA）为0.57，接近FAO/WHO标准规定的0.4和0.6。此外还含有肌肽、γ-氨基丁酸（Gamma-Aminobutyric Acid，GABA）和丰富的钙质。

表1 原料与产品成分表

表2 鲜味剂氨基酸组成分析表

2.3 原料和产品中挥发性风味化合物比较分析

鲢鱼肉中挥发性风味成分经气相色谱-质谱联用仪40 min内即能完全解析，解析出的成分以挥发性羰基化合物和醇类为主，也含有少量的酯类和硫醚类化合物。研究发现，新鲜鲢鱼鱼肉中的气味活性物质主要有己醛、庚醛、戊醇、辛醛和(Z)-2-戊烯-1-醇等烯醇、烯酮、烯醛类化合物，如六碳化合物己醛可以产生一种明显的原生味、鲜香类植物香和醛的特征香味，8个碳原子的挥发性醇和羰基化合物能产生特殊的类似植物的新鲜香气，9个碳原子的化合物(E)-2-壬烯醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛和3,6-壬二烯-1-醇是新鲜鱼类中类黄瓜香和类蜜瓜香的来源[10-12]。

本次实验检出此类化合物相对百分含量高达55.42%。在用鲢鱼制备鲜味剂的过程中，其经过菌酶协同作用、菌体自溶和轻度美拉德反应后，其挥发性羰基化合物和醇类的相对百分含量降低至5.53%，杂环类化合物含量显著增加，可能是经美拉德和热解反应生成的，其中2-苄基（苯甲基）异氰化含量高达66.19%，有典型香气[13-15]。总体来说，与鲜味剂气味相关的化合物多为六碳至九碳化合物、含氮类物质[16-19]，且相对分子质量分布范围主要在80～200，这些化合物通过协同增效构成了鲢鱼鲜味剂独特滋味和气味。原料和产品中挥发性成分的种类及相对含量具体见表3。

表3 原料和产品中挥发性成分的种类及相对含量比较分析表

2.4 产品中呈味物质分析

一般呈味氨基酸主要包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸和脯氨酸，从表1数据可看出本产品中呈味氨基酸占游离氨基酸总量的55.68%。谷氨酸钠的呈味阈值为0.012 g·kg-1，而天门冬氨酸钠的呈味阈值0.01 g·kg-1，本产品中谷氨酸、天门冬氨酸的含量分别为3.02%和1.74%，为主要的呈鲜味物质，而鸟氨酸的呈味阈值为0.012 g·kg-1，肌苷酸二钠的呈味阈值为0.025 g·kg-1[20]，本产品中I+G的含量为0.166%。谷氨酸钠、天门冬氨酸钠与I+G的协同增效作用极大地提升了产品的鲜度。

2.5 产品重金属含量和卫生指标分析

鲜味剂中重金属砷、铅、镉和汞的含量分别为0.036 g·kg-1、0.005 g·kg-1、0.001 g·kg-1、0.029 g·kg-1，均远低于《食品安全国家标准 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）中规定的砷1.0 g·kg-1、镉0.1 g·kg-1、汞0.1 g·kg-1的限量。鲜味剂中菌落总数＜10 CFU/100 g，大肠杆菌数＜30 MPN/100 g，远低于《食品安全国家标准 水产调味品》（GB 10133—2014）中规定的菌落总数和大肠杆菌限量要求。

3 结论

以鲢鱼为原料，通过菌酶协同作用联合轻度美拉德反应技术制备鲜味剂，对产品进行了综合分析，可以得出如下结论：与目前的酶解法和自然发酵法生产过程相比，本工艺省去了大量商品酶的使用，极大地降低了成本，全部生产时间仅130 h，提高了生产效率。产品呈味化合物含量丰富，谷氨酸钠、天门冬氨酸钠与I+G的总含量高达4.926%，挥发性化合物中2-苄基（苯甲基）异氰化含量高达66.19%；产品营养素全面，钙质含量为1.9%，富含18种氨基酸，其中EAA/NEAA值为0.57；产品卫生安全，重金属含量远低于《食品安全国家标准 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）中的限量要求，菌落总数、大肠菌群及致病菌含量符合《食品安全国家标准 水产调味品》（GB 10133—2014）规定要求，是一种营养、安全的鱼制调味品。