超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中的氯霉素和地塞米松的药物残留

时间：2024-07-28

◎ 周莹莹，刘定舟，张丹鹤，李帅，崔倩倩，朱欣欣，贾松涛，赵林萍

（1.河南中标检测服务有限公司，河南郑州 450001；2.郑州中道生物技术有限公司，河南郑州 450001）

随着人们生活水平的提高，肉、蛋、奶畜禽产品在人们的饮食结构中所占比例越来越大，畜禽产品质量受到了更多的关注[1]。养殖户在养殖过程中，为了预防和治疗疾病或为了缩短出栏时间会使用兽药，但是过量使用兽药会造成兽药在动物体内蓄积，一经食用，会给人体健康带来无法挽回的伤害。氯霉素是一种常用的具有旋光活性的广谱抗生素，治疗畜禽肠道感染十分有效，但长期食用含氯霉素残留的动物产品或乳汁，就会对人体健康造成极大的威胁，严重者会引起再生障碍性贫血和灰婴综合症等，甚至危及生命[2]。地塞米松又名氟美松、氟甲强地松龙、德沙美松，是由肾上腺皮质部分所分泌的一种固醇类化合物。超生理剂量的地塞米松具有很强的抗炎和一定的抗过敏作用，在兽医临床上被广泛用于抗炎、抗毒、抗过敏和抗风湿等治疗[3]。激素的频繁使用会在畜禽体内残留，不仅给动物源食品安全带来隐患，而且对人体健康及环境危害严重[4]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：冷冻或新鲜的阴性牛肉、鲤鱼、鸡蛋、牛奶；0.22 μm微孔有机相滤膜。

试剂：甲醇（色谱级，格里斯），乙腈（色谱级，格里斯），乙酸乙酯（色谱级，格里斯），正己烷（色谱级，格里斯），氯化钠（AR），去离子水；氯霉素标准品（批号G974527，纯度99.80%，美国DR）；氯霉素-D5（批号210696，含量100 mg·L-1，Anpel）；地塞米松（批号G1069503，纯度99.82%，美国DR）。

1.2 仪器与设备

TSQ Vantage UPLC-MS/MS（美国赛默飞）；天平：0.01 mg；振荡器、均质器、漩涡混合器、离心机、水浴氮吹仪和移液枪。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

（1）标准储备液的配制。精确称10 mg（需折算成纯物质）氯霉素和地塞米松标准品到100 mL的容量瓶内，甲醇溶解并定容，配成100 mg·L-1的标准储备液，-18 ℃温度下保存。

（2）中间工作溶液的配制。氯霉素-D5中间工作液（100 ng·mL-1）：准确移取100 μL氯霉素-D5标准品溶液到100 mL容量瓶内用甲醇定容，-18 ℃温度下保存；氯霉素、地塞米松中间工作液（100 ng·mL-1）：分别准确移取100 μL地塞米松和氯霉素储备液到100 mL容量瓶内并用甲醇定容，-18 ℃温度下保存。

（3）标准曲线工作液的配制。分别吸取氯霉素、地塞米松中间工作液0.05 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、5.00 mL和10.00 mL于50 mL容量瓶中，分别加入2.5 mL氯霉素-D5中间工作液后用甲醇溶液（甲醇∶水体积比=1∶1）定容，得到氯霉素、地塞米松浓度为0.1 ng·mL-1、0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1，氯霉素-D5浓度为5.0 ng·mL-1。

1.3.2 样品前处理

（1）提取。取制备均匀的试样，准确称量样品2.000 00 g（精确至0.01 mg），于50 mL具塞离心管中，加入氯霉素-D5内标溶液（100 ng·mL-1）50 μL，加标管再加入适量外标溶液，漩涡混合器上涡旋30 s，加入乙酸乙酯20 mL，均质30 s，具塞，振荡15 min，高速低温离心300 s，上清液全部取出待处理，20 mL乙酸乙酯加入残渣中再次进行上述步骤，合并全部上清液，45 ℃水浴氮气吹干，加1 mL甲醇溶液（甲醇∶水=1∶1）定容，涡旋混合，待进行下一步。

（2）净化。加入5 mL正己烷混匀（由于样品中脂肪含量过高，需要去除脂肪，减少干扰，更有助于样品检测），静待分层，吸取下层液体到已加入正己烷5 mL的离心管内，在下层甲醇溶液中加入稍微过量的氯化钠，涡旋混合30 s，10 000 r·min-1下低温离心5 min（如果此时还浑浊，可放冰箱冷冻10 min），然后取下层清液过滤膜，供UPLC-MS/MS测定。

1.3.3 仪器条件

（1）液相色谱条件。色谱柱：waters BEH C18，粒径1.7 μm， 2.1 mm×50 mm；流动相：纯水+乙腈，流速：0.25 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：2 μL，洗脱时间：5 min。

（2）质谱条件的选择和优化。采用直接进入质谱仪的方式，在负离子模式下，对氯霉素、氯霉素-D5以及地塞米松母离子及子离子进行优化。

（3）标准曲线的配制。配制氯霉素、地塞米松浓度为0.1 ng·mL-1、0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1，其中氯霉素-D5浓度为5 ng·mL-1的系列标准曲线。

（4）试样溶液的测定。采用自动进样的方式，标曲溶液进入UPLC-MS/MS中，以氯霉素浓度为横坐标，氯霉素和氯霉素-D5峰面积比值为纵坐标绘制标准曲线，内标法定量；以地塞米松色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制成标准曲线，外标法定量[5-6]。样品溶液以保留时间及两对离子（定性离子对/定量离子对）色谱峰相对丰度比双重定性，以氯霉素和氯霉素-D5峰面积比值带入标准曲线定量，而地塞米松则是以峰面积带入标准曲线定量。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化结果

对质谱条件进行优化，选取1个母离子和2个最优子离子，碰撞能、定性离子对和定量离子对结果见表1，总离子流图见图1，提取的定性离子对色谱图见图2、图3和图4。离子源：电喷雾离子源ESI；扫描模式：负离子模式；检测方式：多反应监测模式（MRM）；喷雾器温度：320 ℃；毛细管温度：320 ℃；鞘气压力40 Arb；辅助气压力15 Arb；喷雾电压3 000 V。

表1 氯霉素、氯霉素-D5、地塞米松多反应监测检测条件表

2.2 线性范围、定量限

在优化好的液相和质谱条件下，通过自动进样的方式，用上述的地塞米松和氯霉素的工作曲线，以信噪比＞10∶1确定定量限。在0.1～20.0 ng·mL-1的线性范围内，相关系数r2＞0.999 0，本方法氯霉素定量限为0.1 μg·kg-1，地塞米松为0.2 μg·kg-1。

2.3 方法回收率和精密度

准确称取阴性的牛肉、鲤鱼、鸡蛋、牛奶这4种基质的样品各18份，每6份为1组（n=6），分为3组，各自添加氯霉素和地塞米松，添加水平0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1，平均回收率和批内相对标准偏差（RSD）见表2。从表2可以看出，4种不同基质中待测物回收率均在78.2%以上，RSD均在10.4%以下。

表2 不同基质结果数据表