番茄红素灵芝孢子油软胶囊的毒理学和免疫功能试验研究

◎ 随晶晶，焦春伟,2，陈家明，岑思恩，郑娇吉，谢意珍,2

（1.广东粤微食用菌技术有限公司，广东 广州 510663；2.广东粤微生物科技有限公司，广东 肇庆 526000）

灵芝是多孔菌真菌赤芝［Ganoderma lucidum（Leyss.exFr.）Karst.］或紫芝（Ganoderma sinenseJ.D. Zhao，L.W. Hsu & X.Q. Zhang）的干燥子实体[1]。灵芝菌丝体成熟后释放的卵型生殖细胞是灵芝孢子，含有水溶性膳食纤维、水解氨基酸等营养成分[2-3]。采用破壁、超临界CO2流体萃取浓缩灵芝孢子粉，得到含有三萜、不饱和脂肪酸等有效成分的油状脂质物灵芝孢子油。研究表明，灵芝孢子油具有增强免疫力[4-6]、心脏保护和促进伤口愈合等作用[7-8]。

番茄红素是植物性食物中存在的一类胡萝卜素，存在于许多红色蔬菜水果中。研究表明，番茄红素具有增强免疫力、保护神经、调节糖代谢和脂代谢及预防心血管疾病等作用[9-12]。本研究对番茄红素灵芝孢子油软胶囊开展毒理学和免疫学功能试验，以期为番茄红素灵芝孢子油软胶囊新产品开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 受试物

粤微牌番茄红素灵芝孢子油软胶囊，广东粤微食用菌技术有限公司。

1.2 试验动物与试验环境条件

KM小鼠：SPF级，购自广东省医学试验动物中心，生产许可证号为SCXK（粤）2013-0002，质量合格证编号分别为44007200036794、4407200037628、44007200037398和44007200040297；饲料：广东省医学试验动物中心；动物试验室环境：屏障环境，使用许可证号为SCXK（粤）2013-0011，室温20～26 ℃，湿度40%～70%。

1.3 仪器与试剂

二氧化碳培养箱，美国Thermo Fisher公司；CASY DT型细胞计数仪，德国Innovatis公司；SOFT maxPRO酶标分析仪，瑞士Tecan公司；超净工作台；JJ1000型电子天平，江苏常熟市双杰测试仪器厂。

环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX），Sigma（生产批号：IVXBC0418V）；NaN3，Sigma-Aldrich（生产批号：BCBM5389V）；2-AF，Sigma-Aldrich（生产批号：SLBC3357V）；敌克松，First Standard（生产批号：ALT600523）；丝裂霉素C，Sigma-Aldrich（生产批号：SLBF5285V）；1,8-二羟蒽醌，Sigma-Aldrich（生产批号：STBD7414V）。

1.4 试验方法

1.4.1 小鼠急性经口毒性试验

选体重为18～22 g小鼠20只，雌雄各半，动物禁食16 h，不限制饮水，按照0.2 mL/10 g bw（20.0 g受试物加玉米油定容至40.0 mL配制）间隔4 h灌胃2次，连续观察7 d，记录小鼠中毒症状和死亡情况。数据用SPSS 13.0统计软件统计。

1.4.2 小鼠骨髓细胞微核试验

将60只小鼠随机分阴性对照组、阳性对照组和低、中、高3个剂量组，雌雄各半。各组以0.2 mL·（kg bw）-1剂量灌胃，阴性对照组（玉米油），受试物低、中、高 剂 量[2.50 g·（kg bw）-1、5.00 g·（kg bw）-1、10.00 g·（kg bw）-1剂量]，阳性对照组[（40 mg·（kg bw）-1剂量的CTX溶液）]。以相同剂量染毒，间隔24 h，第2次染毒6 h后处死小鼠，取其胸骨骨髓制片，吉姆萨染色，每只小鼠在油镜下记录1 000个嗜多染红细胞（Polychromatic Erythrocytes，PCE）并计算各组微核发生率（%）。统计看到200个PCE时的成熟红细胞（Normochromatic Erythrocyte，NCE）数，计算嗜多染红细胞数与成熟红细胞数的比值（PCE/NCE）。数据用泊松分布方法作统计学分析。

1.4.3 小鼠精子畸形试验

将雄性小鼠30随机分为低、中、高3个剂量组、阴性对照组和阳性对照组，各组以0.2 mL/10 g bw每天灌胃1次，连续5天。阴性对照组（等量玉米油），受试物低、中、高剂量组[2.50 g·（kg bw）-1、5.00 g·（kg bw）-1、10.00 g·（kg bw）-1剂量]，阳性对照组[40 g·（kg bw）-1剂量的CTX溶液]。染毒后34 d后处死小鼠，取双侧副睾制片并染色，在高倍镜下镜检观察每只小鼠，并计数1 000条完整的精子。每组共检查5 000条精子，计算精子畸形发生率（‰）。数据用Wilcoson秩和检验方法作统计学分析。

1.4.4 Ames试验

选用组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌株TA97、TA98、TA100和TA102，向顶层培养基中加入试验菌株增菌液0.10 mL，受试物溶液0.1 mL（50.00 mg·mL-1、10.00 mg·mL-1、2.00 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1和0.08 mg·mL-1二甲基亚砜溶解液）和多氯联苯（PCB）0.5 mL诱导的大鼠肝脏匀浆S9液为代谢活化系统，同时设置未处理对照组、溶剂对照组（二甲基亚砜）及阳性对照组（NaN3、2-AF、敌克松、丝裂霉素C和1,8-二羟蒽醌）。染毒后以37 ℃条件下培养48 h，记录每皿回变菌落数。

1.4.5 免疫功能试验

将小鼠分为低、中、高剂量组和阴性对照组4组，低、中、高剂量组分别灌胃40 mg·（kg bw）-1、80 mg·（kg bw）-1、250 mg·（kg bw）-1的番茄红素灵芝孢子油软胶囊，持续4周。根据《保健食品检验与评价技术规范》要求进行迟发性变态反应、淋巴细胞转化和抗体生成细胞试验。试验结果以（xˉ±s）表示，组间比较采用方差分析。

2 结果与分析

2.1 小鼠急性经口毒性试验

受试物急性毒性试验结果如表1所示，小鼠口服受试物在一周观察期内未见任何中毒症状，无一例动物死亡，MTD＞20 g·（kg bw）-1。按照急性毒性分级的评价标准，无毒性。

表1 受试物急性毒性试验结果表

2.2 小鼠骨髓细胞微核试验

阳性对照组（CTX）雌雄小鼠微核率显著高于阴性对照组（P＜0.01）；各剂量组雌雄小鼠微核率、NCE、PCE/NCE与阴性对照组无显著性差异（P＞0.05），微核试验结果为阴性（见表2）。

表2 受试物对小鼠骨髓细胞微核试验结果表

2.3 小鼠精子畸形试验

阳性对照组（CTX）雄性小鼠精子畸形率显著高于阴性对照组（P＜0.01）；各剂量组雄性小鼠精子畸形率与阴性对照组无显著性差异（P＞0.05），每个剂量组分别与阴性对照组比较，畸形率至少为阴性组的倍数或经统计有显著意义即判定为阳性。因此，精子畸形试验结果为阴性（见表3）。

表3 受试物对小鼠精子畸形试验结果表

2.4 Ames试验

受试物对鼠伤寒沙门氏菌的回变菌落数结果如表4所示。各剂量组的回变菌落数与阴性对照组无显著性差异（P＞0.05）；当受试物组回变菌落数增加1倍以上（即回变菌落数等于或大于2乘以未处理对照数），并有剂量-反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应即判定为阳性。本试验4种菌株各剂量回变突变菌落数低于阴性对照组2倍，Ames试验阴性。

表4 受试物对鼠伤寒沙门氏菌的回变菌落数表

2.5 免疫功能试验

受试物的免疫功能试验结果如表5所示，与阴性对照组比较，低剂量组能显著增加足跖增厚值（P＜0.05），中剂量组能显著增强Con A诱导脾淋巴细胞增殖（P＜0.05），中剂量和高剂量组能显著增加溶血空斑数（P＜0.01）。结果表明，绵羊红细胞诱导的小鼠迟发性变态反应、Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞转化增殖试验和绵羊红细胞免疫受试动物后脾细胞抗体生成的试验结果均为阳性。体液免疫由B细胞介导，主要针对胞外病原体与毒素；细胞免疫由T细胞介导，主要针对胞内病原体，如胞内寄生菌、病毒等[13]。番茄红素灵芝孢子油软胶囊能够增强细胞免疫和体液免疫功能。

3 结论

本研究中采用MTD的急性毒性试验剂量为20.0 g·（kg bw）-1，相当于受试物日服用量的2 400倍；在10.0 g·（kg bw）-1、5.0 g·（kg bw）-1、2.5 g·（kg bw）-1剂量下进行小鼠骨髓细胞微核试验、精子畸形试验和4种菌种的Ames试验，相当于受试物日服用量300～1 200倍，所有指标均未显示毒性。

功能试验中，受试物能增强脾细胞抗体的生成，表明受试物能够增强机体的体液免疫功能；受试物能进一步增强小鼠迟发性变态反应和脾淋巴细胞转化，表明受试物能增强机体细胞免疫功能。

本研究表明，番茄红素灵芝孢子油软胶囊使用安全且有提高机体免疫力的功能作用，具有保健食品的开发前景。