高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法同时测定鸡蛋中磺胺和硝基咪唑类药物残留

◎ 唐韵熙，白亚敏

（重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121）

鸡蛋作为大众消费产品，已成为家家户户必备膳食。近年来，“兽药鸡蛋”层出不穷，全国各地都相应在鸡蛋中检测出磺胺类、硝基咪唑类、氯霉素类和喹诺酮类药物，这无疑影响着人们的身体健康[1-3]。甲硝唑和地美硝唑作为广谱抗菌药，能够有效驱除动物体内的寄生虫，在养殖过程中投喂该类药物不仅可以有效杀菌，同时也能作为家禽的生长促进剂[4-5]。磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是指含有对氨基苯磺酰胺的一类药物的总称，被广泛用于畜禽生产，特别是养殖密度较大的家禽行业中，以防治细菌感染。消费者在不知情的情况下长期食用含有硝基咪唑类和磺胺类药物的鸡蛋，人体会产生一定的抗药性，影响身体健康[6-8]。杨修镇等[9]指出鸡蛋中磺胺类、硝基咪唑类药物的检出率因产蛋期的非法用药而呈现不规律性。

《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）规定磺胺类以及磺胺二甲嘧啶在产蛋期禁用，《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定，甲硝唑和地美硝唑允许作为治疗用，但不得在动物性食品中检出。目前，磺胺类药物、甲硝唑及地美硝唑的检测方法主要有液相色谱法[10-12]、液相色谱-串联质谱检测法[13-15]、高效毛细管电泳法[16-17]以及酶联免疫法[18-19]等，但是检测方法大多数仅包含一种类型的化合物，不能满足市场需求。本研究通过建立同时检测鸡蛋中磺胺类化合物和硝基咪唑化合物多残留高通量检测方法，能够实现大批量样品高效、准确测定，同时也能对鸡蛋的兽药残留问题起到技术监管作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈（质谱纯，德国Merck公司）；正己烷（色谱纯，美国Honeywell公司）；乙酸乙酯（色谱纯，美国Honeywell公司）；甲酸（质谱纯，美国Sigma公司）；无水硫酸钠（分析纯，重庆川东化工有限公司）；实验室用水为Milli-Q去离子水（美国MIllipore公司）。

甲硝唑、地美硝唑、地美硝唑-D3、磺胺喹恶啉、磺胺地索辛、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑和磺胺甲氧哒嗪标准品购于德国Dr.Ehrenstorfer公司，甲硝唑-D4标准品购于BePure公司，各标准品纯度均≥95%。

标准储备溶液的配制：分别准确称取甲硝唑、甲硝唑-D4、地美硝唑、地美硝唑-D3、磺胺喹恶啉、磺胺地索辛、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑和磺胺甲氧哒嗪各10.00 mg于10 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，配制成质量浓度分别为1.000 mg·mL-1的标准储备液，存储于-20 ℃冰箱中，有效期为12个月。

甲硝唑-D4和地美硝唑-D3混合内标工作溶液配制：分别准确移取1.000 mg·mL-1甲硝唑-D4和地美硝唑-D3储备液各0.1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10 μg·mL-1的混合内标标准工作液1，存储于-20 ℃冰箱中，有效期为3个月；准确移取0.1mL 10 μg·mL-1的混合内标标准工作液1，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成100 ng·mL-1的混合内标标准工作液2，现配现用。

样品鸡蛋购于超市；阴性鸡蛋来源于日常监督检验不含目标化合物的样品。

1.2 仪器与设备

安捷伦1290液相色谱仪（美国安捷伦公司）；AB SCIEX 5500三重四极杆串联质谱仪（美国AB SCIEX公司）；3-30KS型冷冻离心机（德国Sigma公司）；ML-886涡旋仪（海门市其林贝尔仪器）；Turbovap LV全自动浓缩仪（英国Biotage公司）；超纯水系统Milli-q reference 型纯水机（美国MILLIPORE）；MSA225S-100-DU电子分析天平（十万分之一，德国Sartorius公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取溶剂的优化

称取5 g均质的鸡蛋样品于50 mL聚丙烯离心管中，加入100 ng·mL-1甲硝唑-D4和地美硝唑-D3混合内标工作溶液50 μL，分别使用20 mL乙腈、0.1%甲酸乙腈、乙酸乙酯和0.1%甲酸-乙酸乙酯溶液提取，振荡涡旋5 min，加入5 g无水Na2SO4，迅速振摇，于8 000 r·min-1离心10 min，转移上清液至干净玻璃管中，40 ℃氮吹干，加入1 mL 20%甲醇复溶，2 mL正己烷除脂，涡旋30 s，8 000 r·min-1离心5 min，去掉正己烷层，下层溶液重复用正己烷除脂1次，取下层清液过0.22 μm滤膜，待测。

1.3.2 液相色谱与质谱条件的优化

（1）液相色谱条件。色谱柱：A大写 UPLCBEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；流速为0.3 mL·min-1；进样量：2 μL。比较乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-水分别作为流动相对目标化合物分离效果的影响，从而选取最优流动相体系。

（2）质谱条件。电喷雾（ESI）离子源，正离子模式；扫描模式：多反应监测（MRM）；离子源温度：550 ℃；离子源电压：5 500 V；气帘气压力：35 psi；GAS1：55 psi，GAS2：55 psi；选定10种目标化合物的监测离子对，优化去簇电压（DP）和碰撞能（CE）。

1.3.3 基质效应的确定

用经样品前处理（1.3.1）后的阴性基质样液配制目标化合物标准溶液，按1.3.2条件进行测定，以目标物的浓度（X，ng·mL-1）与相应的峰面积（Y）绘制标准曲线，通过基质标准曲线的斜率与纯溶剂标准曲线的斜率之比考察鸡蛋中10种化合物的基质效应。

1.3.4 方法学验证

（1）线性范围及灵敏度。在经1.3.1方法处理后的鸡蛋空白基质提取液中加入适量磺胺类化合物和硝基咪唑类化合物混合标准工作溶液及两种混合内标标准溶液，配制成浓度为2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1（8种 磺 胺 类 化 合 物）和1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1和20 ng·mL-1（2种硝基咪唑类化合物）的基质加标溶液，依次进样，以目标物的浓度（X，ng·mL-1）与相应的峰面积（Y）进行线性回归，1/x为权重，计算鸡蛋阴性基质中添加标准品的信噪比，以S/N≥10作为方法定量限。

（2）回收率与精密度。在阴性鸡蛋样品中分别添加0.2 μg·kg-1、0.4 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1含量的甲硝唑、地美硝唑混合标准溶液，0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1含量的磺胺类化合物混合标准溶液，按照本方法平行测定6次，连续测定3 d，计算加标回收率以及批内、批间标准偏差。

1.3.5 数据处理

将系列标准溶液、样品溶液按优化后的仪器方法上机进行测定，采用MultiQuant 3.0软件进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 提取条件的确定

鸡蛋中水分较多，并且具有蛋白质、脂类等物质，本文比较乙腈、0.1%甲酸乙腈、乙酸乙酯和0.1%甲酸-乙酸乙酯作为提取溶剂对10种目标化合物提取效率的影响。经比较发现，乙腈虽然具有沉淀蛋白的作用，但是氮吹速度慢，提取时长为乙酸乙酯的2倍，不适合大批量样品处理，且最后经正己烷净化后目标层液体不易澄清。综合10种化合物的提取效率，以含有0.1%甲酸的乙酸乙酯最优（见图1），回收率为73%～109%，满足试验要求。所以最后选择0.1%甲酸-乙酸乙酯为该方法的提取溶剂。

图1 不同提取溶剂对10种化合物提取效率的影响图（n=6）

2.2 液相色谱与质谱条件的确定

2.2.1 色谱条件优化

选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，比较乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-水分别作为流动相对目标化合物分离效果的影响。结果表明，10种化合物在以甲醇和水作为流动相，灵敏度最好，但是色谱峰型以乙腈-0.1%甲酸水最优，可能是由于磺胺类化合物的结构带氨基，呈弱碱性，在水中加入0.1%甲酸有助于待测物的母离子[M+H]+的形成，提高离子化效率，硝基咪唑类化合物在酸性条件下也可以改善峰型。

在1.3.2条件下，鸡蛋阴性基质中添加浓度为5 ng·mL-1的10种化合物的总离子流图见图2。地美硝唑和磺胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶和磺胺喹恶啉分别有相同的保留时间，但是由于其化合物的母离子与特征碎片离子不同，因此可以较好区分。最终在满足检测要求的情况下，选择乙腈-0.1%甲酸水作为流动相，流动相梯度为：流动相A 0.1%甲酸水溶液；流动相B 乙腈。梯度洗脱程序：0～0.5 min，10%B；0.5～3.0 min，10%B→90%B；3.0～5.0 min，90%B；5.0～5.1 min，90%B→10%B；5.1～7.0 min，10%B。

图2 阴性基质中10种化合物（5 ng·mL-1）的总离子流图

2.2.2 质谱条件优化

磺胺类化合物和硝基咪唑类化合物结构中分别含有磺酰胺基、硝基、咪唑环等供电基团，该试验选择正离子模式电离，对浓度为20 ng·mL-1的10种化合物混合标准溶液进行一级质谱扫描，优化去簇电压（DP），确定[M+H]+母离子。通过优化碰撞能（CE）将母离子碰撞产生碎片离子进行二级质谱扫描，经试验优化，10种化合物的定性和定量特征离子及优化质谱参数见表1。

表1 10种化合物的质谱参数表

2.3 基质效应

鸡蛋中含有较丰富的蛋白质、脂肪，特别是磷脂类化合物，若这些物质与目标化合物共流出，会使定性定量结果不准确，而使用基质标准曲线进行校准能够减小基质效应。本试验利用鸡蛋阴性基质配制基质标准曲线，通过基质标准曲线的斜率与纯溶剂标准曲线的斜率之比考察鸡蛋中10种化合物的基质效应，比值小于1为基质抑制，比值大于1为基质增强[20-21]。10种化合物的斜率比值见图3。结果表明，磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺地索辛、磺胺喹恶啉、磺胺嘧啶和地美硝唑受基质效应影响较大。其中除磺胺嘧啶呈基质增强，其余均为基质抑制。故本研究最终采用基质标准曲线来提高试验的准确性。

图3 10种化合物的基质效应图

2.4 方法学评价

结果表明，10种化合物得到的线性关系良好（见表2），磺胺类化合物的定量限为0.5 μg·kg-1，硝基咪唑的定量限为0.2 μg·kg-1，满足检测要求。由表3可知，10种化合物的平均回收率范围为66.3%～107.9%，批内精密度范围为3.5%～15.0%，批间精密度范围为3.8%～13.0%，该方法灵敏度较好，准确度以及精密度较高。

表2 10种化合物的线性关系、仪器定量限、保留时间表

表3 10种化合物的平均加标回收率、RSD表

2.5 实际样品检测

利用本文建立的分析方法，对市场上近500余批鸡蛋进行测定。其中阳性样品有19批，不合格化合物主要是磺胺嘧啶（6批次，检出含量为14.93～1 162.95 μg·kg-1）、磺胺间甲氧嘧啶（4批次，检出含量为8.99～75.05 μg·kg-1）、磺胺二甲嘧啶（2批次，检出含量为220.10～935.44 μg·kg-1）、甲硝唑（3批次，检出含量为5.86～2 150.30 μg·kg-1）和地美硝唑（4批次，检出含量为8.8～64.0 μg·kg-1）。本分析方法适合大批量样品的定性和定量分析检测。

3 结论

本文通过优化提取溶剂、色谱-质谱条件，并进行方法学验证，建立了高效液相色谱-串联质谱法同时检测鸡蛋中8种磺胺类化合物和2种硝基咪唑类化合物。本研究的方法灵敏度高、选择性好、前处理方法简单，线性关系、回收率等方法学指标较好，分析时间短，能够同时检测两种类型的鸡蛋兽药残留物。后续研究还将进一步优化前处理方法，扩大适用范围，分析多种动物源性食品中磺胺类化合物和硝基咪唑类化合物的检测方法。