水产品中磺胺类药物检测能力验证质量控制分析

◎ 冯慧慧，杨亚琴，余明霞，曹 秀，李圆圆，郝学飞

（河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（郑州），河南 郑州 450002）

磺胺类药物是对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，因其具有性质稳定、抗菌谱广、杀菌效果好、使用方便和价格低廉等优点，在水产品养殖过程中仍然广泛使用，主要用于预防和治疗鱼、虾、蟹等动物的细菌感染性疾病[1-2]。由于磺胺类药物在生物体内作用时间和代谢时间较长，在水产品体内蓄积到一定浓度，经食用后会对人体产生毒副作用，引发排尿和造血紊乱等副作用和过敏反应，使免疫功能下降，致残、致畸、致突变，并且可能产生致癌作用[3]。因此，我国以及美国、欧盟等多数国家对食品中磺胺类药物残留最高限量均有明确规定，如我国《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）规定所有食品动物肌肉、脂肪、肝和肾中磺胺类药物的最大残留限量为100 µg·kg-1[4]。近年来，磺胺类药物残留的问题也越来越受社会的关注，农业农村部、各地方政府等也多次组织实施水产品例行监测、专项监测等各类抽检工作，以确保水产品质量安全。

能力验证是通过各实验室之间的比对，来对实验室能力进行考核、监督和确认的一种验证活动，它可以作为质量控制的外部补充措施，以促进实验室检测能力和质量管理水平的不断提高[5-6]。本实验室近年来也多次参加农业农村部组织的能力验证考核活动，本文以2021年参加农业农村部组织的水产品中磺胺类药物残留检测能力验证为例，检测方法推荐使用《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定》（农业部1077号公告-1-2008）[7]，优化了提取溶剂和净化方式，对考核样品中磺胺类药物残留量进行测定，取得了满意的实验结果。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Shimadzu LCMS-8050液相色谱-串联质谱仪，日本岛津公司；色谱柱：C18柱（100 mm×2.0 mm，3 μm），日本资生堂公司；PGC 4502i电子天平，精确至0.01 g，艾德姆衡器（武汉）有限公司；AE 240电子天平，精确至0.01 mg，梅特勒-托利多；飞鸽GL-21B 高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SKQ-500DE型数控超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SK-1快速混匀器，金坛市白塔新宝仪器厂；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司。乙腈、甲醇：色谱纯，德国Merck公司；甲酸：色谱纯，赛默飞世尔科技公司；固相萃取净化柱：Oasis PRiME HLB，规格为500 mg/6 mL，美国Waters公司。

磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺二甲异噁唑、磺胺喹噁啉、磺胺间二甲氧嘧啶、氘代磺胺邻二甲氧嘧啶-D3以及氘代磺胺间二甲氧嘧啶-D6共计10种化合物标准物质均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司，纯度均大于99.0%。

能力验证样品：离心管包装的鲤鱼鱼糜，共3份样品（每份样品5.00 g），空白基质样品约50 g。检测样品编号为H47，由中国水产科学研究院质量标准研究中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 样品提取

样品充分解冻至室温，加入200 ng·mL-1混合内标标准溶液200 µL，涡旋混合1 min，避光放置1 h，再加入20 mL乙腈进行提取，涡旋混合2 min，室温下超声提取10 min，以8 000 r·min-1高速离心5 min，取上清液于50 mL烧杯中；残渣用10 mL乙腈重复提取一次，合并两次提取液，待过柱净化。

1.2.2 样品净化

将全部上清液转移至Oasis PRiME HLB固相萃取柱进行净化，保持流速1～2滴/s，收集全部滤液于梨形瓶中，40 ℃水浴旋转蒸发至近干，加入2 mL 20%甲醇水涡旋溶解残留物，过0.22 µm微孔滤膜，待上机测定。

在测定能力验证样品时，先取出一份样品按照上述方法进行预处理粗略定量。根据预实验粗略定量结果，考核样品中磺胺甲基嘧啶浓度大约为24 µg·kg-1，磺胺二甲嘧啶浓度大约为40 µg·kg-1。可根据这个量进行加标样品的制备，再根据加标样品的实测值和添加量计算出添加回收率，由此可以对考核样品的测定值进行校正，另外可以根据初测结果准确配制标准曲线浓度范围，使能力验证样品中磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲嘧啶上机液浓度涵盖在标准曲线范围内，且在标准曲线的中区值，使定量结果更加准确。

1.2.3 样品检测

（1）色谱条件。色谱柱：资生堂C18柱（100 mm×2.0 mm，3 μm）；柱温：40 ℃；进样体积：2 µL；流动相A路：5 mmol·L-1甲酸-甲酸铵水溶液；流动相B路：甲醇∶乙腈（V∶V）=1∶1；流速：0.20 mL·min-1；梯度洗脱程序详见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序表

（2）质谱条件。离子化模式：电喷雾离子源（ESI），正离子模式；扫描方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；雾化气：空气，流速3.0 L·min-1；干燥气：氮气，流速10.0 L·min-1；加热气：氮气，流速10.0 L·min-1；离子源接口温度：300 ℃；脱溶剂管温度：250 ℃；加热模块温度：400 ℃；碰撞诱导电离气体压力270 kPa，各化合物质谱采集信息详见表2。

表2 磺胺类药物质谱参数信息表

2 结果与分析

2.1 检测结果

样品经基质标准曲线校准后，检测结果见表3，磺胺类混合标准溶液图谱见图1，考核样品图谱见图2，经农业农村部能力验证通报，此次考核结果合格。

图1 磺胺类混合标准溶液（20 ng·mL-1）总离子流图

图2 考核样品总离子流图

表3 考核样品检测结果表

2.2 提取溶剂的优化与选择

《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（农业部1077号公告-1-2008）[7]选用1%甲酸乙腈作为提取溶剂，主要是针对磺胺类和喹诺酮类药物残留量的同时测定，适量的甲酸更有利于喹诺酮类药物的提取。本次考核只涵盖其中8种磺胺类药物（磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺二甲异噁唑、磺胺喹噁啉和磺胺间二甲氧嘧啶），结合磺胺类药物本身的性质，考前做多次预备实验，比较标准中所用的1%甲酸乙腈和乙腈作为提取剂对化合物灵敏度和实验回收率的影响。实验结果如图3所示，选用乙腈作为提取剂时，磺胺类药物响应明显提高，实验数据稳定性好，与刘新辉[8]、蒋定之[9]文中提到随着甲酸比例的增加，磺胺类等碱性化合物回收率降低的研究结果一致。因此，选用乙腈作为本次考核实验的提取溶剂。

图3 不同提取溶剂对磺胺类药物响应值的影响图（n=3）

2.3 净化方式的优化与选择

用新型固相萃取净化柱Oasis PRiME HLB代替正己烷液液萃取除脂净化。检测标准《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（农业部1077号公告-1-2008）[7]关于磺胺类药物检测的前处理净化步骤较少，只是将提取液旋转蒸发浓缩后的残留物复溶，用2 mL正己烷液液萃取除脂净化后上机测定。

因水产品中含有大量蛋白质、脂肪、磷脂等化合物，传统的正己烷液液萃取不能有效去除样品中的蛋白质和卵磷脂，容易造成基质干扰，影响离子化效率，从而影响化合物的灵敏度，且净化不彻底会对仪器色谱柱和质谱端造成较大污染。因此，本研究选用了目前新型Oasis PRiME HLB柱，不需要活化、淋洗、洗脱等步骤，操作简单快速，可有效去除样品中脂肪、蛋白质、内源性磷脂类等物质干扰，极大地减少干扰物对目标化合物的影响，且减小基质效应对实验定量结果的影响[8-10]。实验结果还表明Oasis PRiME HLB净化柱对磺胺类化合物吸附很少，回收率稳定可满足检测要求，详见图4。

图4 经Oasis PRiME HLB柱净化后化合物回收率情况图（n=3）

3 兽药残留能力验证注意事项及质量控制分析

3.1 能力验证前注意事项

3.1.1 所用试剂、器皿的处理

将实验过程中所用到的器皿按照规定要求清洗，并用甲醇润洗，对于口径较小的进样小瓶，可用甲醇超声清洗，尽量避免实验器皿带来的外源污染。

3.1.2 标准溶液的配制

对照标准物质证书，确认标准物质的有效期、结构、纯度，根据标识的纯度进行折算，部分磺胺类标准品在甲醇中的溶解度不好，可以加入适量甲酸超声助溶。

3.1.3 仪器条件的优化

确认实验过程中所用到的仪器设备状态，必须保证在检定或校准有效期内；考核前对仪器进行简单维护，清洗离子源，做仪器校准等，确保仪器能够满足实验灵敏度和稳定性要求。

3.2 能力验证中质量控制分析

3.2.1 同步做好质量控制

实验室在做能力验证考核样品的同时，应做好质量控制。质量控制包括试剂空白、基质空白和质控样品（添加回收）。试剂空白和基质空白可用来确认在检测过程中所用到的试剂是否存在干扰或污染；若有干扰存在，在进行定量结果计算时可以及时扣除，避免检测结果偏高，超出能力验证判定标准。质控样品可确保检测结果的准确度，同批次质控样品回收率满足要求，考核样品的检测结果一般也会在允许的误差范围内。

3.2.2 注意内标物与目标物的同步

能力验证考核样品一般采用的是向空白基质中添加目标物的方式，制备好的样品会放置一段时间后发放给各个参加考核的单位进行检测，而内标物是各个单位在进行检测时自行添加的，这会使得内标物与目标物存在一定的时间差。为尽量减小两者时间差带来的影响，各检测单位应在接收样品后充分解冻，加入内标物后，避光放置30～60 min，再按照规定的检测方法进行实验前处理，尽量使内标物与目标物状况保持一致，保证实验结果的准确性[6]。

3.2.3 基质效应的消除

基质效应是指样品中除目标分析物以外的组分，常对目标物的分析有显著的干扰，并影响检测结果的准确性，这些影响和干扰称为“基质效应”。不同的基质可能对目标分析物产生增强或减弱效应，因此在样品进行准确定量时，可以选用空白基质液配制标准曲线的方法来减小基质效应的影响[11-12]。

4 结论

本研究结合使用Oasis PRiME HLB固相萃取净化柱对实验前处理提取溶剂和净化方式进行改进，优化仪器检测条件。结果表明该方法具有快速、简单易操作、基质干扰小等优点，并将该方法应用于本次水产品中磺胺类药物能力验证考核，取得了满意的实验结果。此外，通过本次考核实验，认真总结了检测过程中的注意事项及质量控制技巧，使检测人员的实验操作能力得到提升，同时也保证检测机构出具准确、公正、有效的检测数据，提高水产品质量安全监管水平，保障水产品质量安全。