发酵乳中三氯蔗糖检测方法的改进

◎ 李加辉，崔瑞霞，赛 平，王 乾，翟于尊

（河南中测技术检测服务有限公司，河南 郑州 450000）

发酵乳是一种较为健康的食品。发酵乳中含有多种乳酸菌，符合现代人对健康饮食的需求，具有较大的发展前景。为了满足消费者的口味，生产商在发酵乳生产过程中添加食品添加剂，对其进行不同程度的调配[1-3]。目前乳制食品中添加剂的监管项目主要包括微生物、维生素和质量指标等，发酵乳制食品中的三氯蔗糖检测也存在检测限值。

《食品安全国家标准 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》（GB 22255—2014）测定发酵乳中三氯蔗糖用的是甲醇去除蛋白质，再对提取溶剂进行缩分，目的是去除蛋白质对三氯蔗糖峰的干扰，整个操作过程用时较长，且很烦琐，对检测结果的准确性和重复性造成直接影响[1]。有研究采用亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液沉淀蛋白质，效果较好，但该方法对样品进行了稀释，降低了提取液中三氯蔗糖的含量，不利于三氯蔗糖含量较低的发酵乳的检测[2-8]。国家标准使用液相色谱，用RID或ELSD检测器进行食品中三氯蔗糖的测试。但在食品实验室中，UV和DAD的普及度更高。本文以乙酸沉淀法进行前处理，采用HPIC-DAD进行食品中三氯蔗糖的检测，通过对实验条件的改变与优化，建立一种适用于批量检测的实验方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵乳，市售；标准品：三氯蔗糖（CAS号：56038-13-2；纯度99.9%；Dr.E）；乙腈、甲醇、乙酸：色谱纯，美国默克公司；0.22 μm有机滤膜、C18固相萃取柱，默克公司；蒸馏水。

1.2 仪器与设备

Waters 液相色谱仪，美国 Waters 公司；DAD 检测器，美国 Waters 公司；XB- C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），美国Phenomenex公司；优普纯水机，美国Millipore公司；电子天平，上海科创色谱科技有限公司；水浴锅，超声清洗仪。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：乙腈+水＝12+88（V/V）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样体积：20 μL；Waters2998 DAD 检测器。

1.3.2 标准溶液的配制

称取三氯蔗糖标准品10.001 2 mg，用流动相溶解，转移至10.0 mL容量瓶中定容至刻度，摇匀得到浓度为1.001 2 mg·mL-1的标准溶液。把标准溶液用流动相逐级稀释成浓度为 0.02 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1和0.80 mg·mL-1的系列标准溶液。

1.3.3 回收率标准溶液的配制

精密称取三氯蔗糖标准品12.52 mg，20%乙腈溶解后转移至25 mL容量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.500 8 mg·mL-1的回收率标准溶液。

1.3.4 样品处理

精确称取5.00 g左右样品于50 mL离心管中，加入10 μL乙酸，涡旋摇匀后，超声处理10 min后，10 000 r·min-1离心3 min，上清液全部转移到C18固相萃取柱（依次用3 mL甲醇、3 mL水活化），用3 mL去离子水淋洗，弃去淋洗液，真空抽干C18柱，用甲醇洗脱，收集洗脱液于50 mL的蒸发皿内沸水浴蒸近干，加入1 mL乙腈水（体积比3∶22）溶解残渣，过0.22 μm有机滤膜后上机测定。

1.3.5 测定

在1.3.1色谱条件下，待仪器基线稳定后，分别注入标准溶液和样品溶液20 μL于液相色谱仪中，记录峰面积，根据标准品的保留时间定性，外标法定量。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的选择

为提高目标物的分离效果及提取效率，通过回收率实验对比4种沉淀蛋白的方法对检测结果的影响。在发酵乳酸性奶油和干酪中分别按照0.1 g·kg-1添加三氯蔗糖，进行回收实验，结果见表1。结果表明，用0.2%乙酸沉淀蛋白，3种不同类别的发酵乳的回收率较稳定，均在86.7%～93.5%。此外，该方法在实验过程中操作简单，用时短，因此本实验采用此方法作为发酵乳中三氯蔗糖测定的前处理方式。

表1 不同前处理方法测定三氯蔗糖的回收率表（单位：%）

2.2 色谱条件的确定

本实验分别采用 2.4 μm、3.7 μm、4.6 μm 色谱填料的色谱柱进行分离，对比发现2.4 μm分离效果显著且最好，同时分析时间最短。由于三氯蔗糖用二极管阵列检测在190～800 nm下光谱吸收递减，所以DAD检测器只能以190 nm的最大吸收来检测。当用大于15%乙腈进行分离时，三氯蔗糖很快出峰，不能较好分离，若调整为小于10%乙腈时，出峰时间太慢、峰较宽且响应比较低，当乙腈为12%，出峰较好，故DAD检测器的流动相比例确定为乙腈∶水=3∶22（V/V）。

2.3 标准曲线与检出限

取1.3.2下的系列标准工作液分别进样20 μL，测定峰面积，用浓度和峰面积进行回归分析。经测定和计算，在进样浓度0.02～0.80 mg·mL-1，峰面积和浓度呈线性，回归方程为y=133 630x-372，相关系数r为0.999 6。采用溶剂稀释法，将三氯蔗糖标准溶液不断稀释，在色谱条件不变情况下进行测定，以3倍信噪比计算检出限为4.6 mg·L-1。按样品取样量为2 g，定容体积为1 mL计算，检出浓度下限为0.002 3 g·kg-1，比现行国标方法相关文献检测方法结果更低[14-15]。

2.4 方法的重复性

在空白发酵乳中加入三氯蔗糖标准溶液制得浓度为0.025 g·kg-1的模拟样品，按上述方法处理，重复进样6次，测定含量，计算相对标准偏差。经测定和计算，进样6次的RSD为0.79%，说明方法的重复性较好，具体见表2。

表2 重复测定结果表

2.5 方法的准确性

以干酪为样品基质，分别加入三氯蔗糖标准溶液制得 0.025 g·kg-1、0.050 g·kg-1、0.200 g·kg-1低中高3个水平的加标，按1.3.4方法处理，测定峰面积，并计算回收率，结果见表3。回收率均符合实验室质量控制相关标准要求[9-13]。

表3 不同浓度下加标回收率表

3 结论

本研究优化了发酵乳中三氯蔗糖的测定方法，通过检出限、重复性和准确性试验表明可以利用乙酸沉淀蛋白法结合DAD检测法达到现行标准要求。乙酸沉淀蛋白法结合DAD检测法测定三氯蔗糖优势是有机试剂使用量节约50%以上，同时操作简单、省时省力。此外，对于食品检测实验室，液相色谱的检测器拥有比例为DAD＞RID＞ELSD，本实验结果显示DAD检测器在检测三氯蔗糖时一样可以达到很好的效果，在大批量检测时，是一种比较值得推广的方法。