雷竹笋壳多糖超声辅助酶法提取工艺 及其抗氧化活性

◎ 刘 于，贺 亮，谢 娜，李 琴，王衍彬，程俊文，赵建诚，陈永健

（1.浙江大学生命科学学院，浙江 杭州 310058；2.国家林业局竹笋工程技术研究中心，浙江省林业科学研究院，浙江省竹类研究重点实验室，浙江 杭州 310023；3.浙江圣氏生物科技有限公司，浙江 湖州 313399）

雷竹是禾本科刚竹属早竹的栽培种。其主要分布于中国浙江。雷竹的竹笋味道特别鲜美，并且笋期较早，持续时间久，因此产量很高,是相当好的笋用竹种。然而，雷竹笋作为一个全绿色纯天然的食物，其蛋白质和膳食纤维的含量都很高，同时糖类和脂类含量也非常低，还富含各种身体所需要的氨基酸和微量矿物质等营养元素，因此受到广大消费者的喜爱。此外，雷竹笋也有着漫长的食用史，它只是人们餐桌上的一个家常菜品[1-3]。竹笋壳作为竹笋食用后的剩余物，也多作为动物饲料，但大部分已被抛弃，无法反映其实用价值。但科学研究表明雷竹笋外壳中还存在着一定的生物活性成分，其中还含有黄酮、多糖、黄酮、甾醇和酚类等，通过开发或再利用雷竹笋壳资源，并提取其中的多糖化合物，不但能够达到资源的高度开发利用，同时在医学研发等方面也有着巨大的发展前景。目前，最常见的多糖萃取方式有热水浸泡提法[4]、酸提法以及碱提法[5]等，其中酸提法以及碱提法对实验设备的要求比较高，并且容易引起多糖结构的改变。超声辅助法有助于减少提取时间，并且适应性广泛、运行成本低。此外，超声辅助法提取的药液中含有的无效杂质比较少，并且提取出的有效成分易于精制。酶解法具有专一性强、高效性的特点，可以催化雷竹笋中纤维素的分解[6]。将超声与酶法结合提取雷竹笋壳多糖，可以使雷竹多糖溶出的效果更佳，并且可提高雷竹多糖获取率[7]。

到目前为止，还未有将超声与酶法结合提取雷竹笋壳多糖的相关文献。本文将采用响应面优化法对超声与酶法结合提取雷竹笋壳多糖的工艺进行相应的优化，来确定其最佳的工艺流程，并对其提取出的雷竹笋壳多糖进行体外抗氧化活性的研究，为能够最大限度地对雷竹笋壳的再加工和综合利用提供理论支撑以及技术支持[8-10]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酚类、单糖标品、葡萄糖刺激标品、95%乙醇和浓硫酸等试剂（分析纯），成都科龙化学品公司；水杨酸、过氧化氢和硫酸亚铁，成都审计意见化学试剂厂；维生素C、2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH），上海阿拉丁生物科技股份有限公司；果胶酶、纤维素酶和蛋白质酶，忆诺联创生物科技公司。

1.2 仪器与设备

R-501型旋转蒸发仪，上海一科仪器有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；ZLS-3型真空离心浓缩仪，湖南赫西仪器装备有限公司；CL31R型多功能高速离心机，美国Thermo公司；SHZ-DⅢ型循环水真空泵，巩义市予划科技有限公司；FA二千零四型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器公司；LT-DBX60N型精密可程序化电烤箱，立德泰勒科学仪器公司。

1.3 试验方法

1.3.1 雷竹笋壳预处理

用水冲洗雷竹笋壳使其洁净后，放在55 ℃的烘箱中烘干，干燥之后打粉，过80目筛，备用[11]。

1.3.2 雷竹笋壳多糖的提取

取一定量的雷竹笋壳粉末，按料液比1∶30（g∶mL）加入蒸馏水，调pH至4.5，加蛋白质酶∶纤维素酶∶果胶酶=1∶1∶1，在一定的温度和超声频率中酶解一段时间，然后将得到的浸提液置于沸水浴中15 min，使酶失活，再将浸提液进行抽滤后，将所得滤液混合，在60 ℃下减压浓缩至1/3体积，加入4倍体积的95%乙醇，然后醇沉24 h，在5 000 r·min-1下离心10 min，收集沉淀，通过冷冻干燥得到雷竹笋壳的粗多糖。

1.3.3 雷竹笋壳多糖得率的测定

标准溶液选取葡萄糖水溶液，将其在490 nm处用紫外-分光光度计测定其吸光度值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到葡萄糖水溶液标准曲线y=1.383 9x+0.036 7，R2=0.988 1，该标准曲线有良好的线性关系。精确称2.0 g雷竹笋壳粗多糖到100 mL的容量瓶中，然后滴加蒸馏水至刻度线来定容，根据标准曲线方程，雷竹笋壳多糖提取率的计算如下：

式中：c为配制多糖溶液浓度，g·L-1；V为粗多糖溶液体积，L；m0为雷竹笋壳质量，g。

1.3.4 单因素试验

在室温下，探究不同超声功率、提取时间、复合酶添加量、料液比以及酶解温度对雷竹笋壳多糖得率的影响。

（1）超声功率的确定。精确称取10 g雷竹笋壳粉，按照物料质量的30倍加入蒸馏水，在提取时间105 min，酶添加量2.0%，酶解温度55 ℃的条件下，分别用100 W、150 W、200 W、250 W和300 W的功率进行超声处理，研究不同超声功率对雷竹笋壳多糖提取率的影响。

（2）提取时间的确定。精确称10 g雷竹笋壳粉，按照物料质量的30倍加入蒸馏水，在超声功率为200 W，复合酶添加量为2.0%，酶解温度55 ℃的条件下，分别提取45 min、75 min、105 min、135 min和165 min，研究不同提取时间对雷竹笋壳多糖提取效率的影响。

（3）复合酶添加量的确定。精确称取10 g的雷竹笋壳粉，按照物料质量的30倍加入蒸馏水，在超声功率200 W，提取时间105 min，酶解温度55 ℃的条件下，分别添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的复合酶，研究不同复合酶添加量对雷竹笋壳多糖提取率的影响。

（4）料液比的确定。精确称10 g雷竹笋壳粉，在提取时间105 min，超声功率为200 W，复合酶添加量为2.0%的条件下，分别在料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50（g∶mL）条件下，研究不同料液比对雷竹笋壳多糖提取效率的影响。

（5）酶解温度的确定。精确称10 g雷竹笋壳粉，在提取时间105 min，超声功率为200 W，料液比1∶30，复合酶添加量为2.0%，酶解温度分别为40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃的条件下，研究不同酶解温度对雷竹笋壳多糖提取效率的影响。

1.3.5 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken进行3因素3水平的响应面试验设计，见表1。

表1 Box-Behnken中心组合设计因素及水平表

1.4 雷竹笋壳多糖的抗氧化研究

1.4.1 DPPH自由基清除率的测定方法

参考李松昂等[12]的研究，配制出0.1～0.5 mg·mL-1不同浓度的雷竹笋壳多糖溶液，待测，各取1.0 mL雷竹笋壳多糖待测溶液置于试管当中，然后添加3.0 mL用95%乙醇溶解的DPPH溶液，混合均匀，避光反应30 min后，在517 nm处测定吸光度。DPPH自由基清除率的计算公式为：

式中：A0为空白样品溶液的吸光度值；A1为样品溶液的吸光度值；A2为以蒸馏水代替DPPH的样品溶液的吸光度值。

1.4.2 羟自由基清除率的测定方法

参考叶兆伟等[13]的方法稍作修改后来测定羟自由基清除率。配制0.1～0.5 mg·mL-1不同浓度的雷竹笋壳多糖待测溶液，将2.0 mL浓度为9.0 mmol·L-1的FeSO4溶液、2.0 mL 浓度为 8.8 mmol·L-1的 H2O2溶液以及2.0 mL浓度为9.0 mmol·L-1的水杨酸乙醇液相继加入到待测溶液中，摇匀，在室温下放置30 min，待其稳定，通过紫外-分光光度计在510 nm波长条件下测定不同浓度的雷竹笋壳多糖样品液的吸光度，采用维生素C溶液作为阳性对照液。羟自由基清除率的计算公式为：

式中：A0为空白样品在510 nm处的吸光度值；Am为样品溶液在510 nm处的吸光度值；Aj为不加显色剂H2O2的吸光度值。

1.4.3 还原能力的测定方法

参考李松昂[12]的方法稍加改动。分别精密吸取1 mL提前配好的不同质量浓度的雷竹笋壳多糖待测液于5个试管中，加入2.5 mL pH=6.6的磷酸盐缓冲液和2.5 mL体积分数为0.01的K3[Fe(CN)6]水溶液，拌匀，放置在50 ℃的恒温水浴中20 min，然后加2.5 mL体积分数为10%的TCA，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液2.5 mL，加入同体积的蒸馏水，然后再加入0.5 mL体积分数为0.1%的氯化铁，在常温下放置10 min，使其充分反应，待溶液的颜色从黄色变为蓝色后，在710 nm下测定吸光度，采用维生素C溶液作为阳性对照液。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 超声波功率的确定

由图1可知，当超声功率低于200 W时，雷竹笋壳多糖提取率随着超声波功率的增加而增大；当超声功率达到200 W后，多糖提取率开始下降，这可能是超声波功率在200 W时，多糖趋于最大提取率，多糖几乎全部溶出，继续增大超声波功率，对多糖提取率没有明显的影响。因此，在后续试验中选取200 W为适宜的超声波功率。

2.1.2 提取时间的确定

由图2可知，当提取时间小于105 min时，提取时间越长，提取效率越高；在提取时间达到105 min以后，雷竹笋壳多糖的提取效率不仅不会因为提取时间的延长而提高，相反发生了些许的减少，这可能是由于提取时间过长，少部分雷竹笋壳多糖出现了分解现象，使雷竹笋壳多糖提取率不能继续增大。因此，雷竹笋壳多糖的最适宜提取时间为105 min。

2.1.3 复合酶添加量的确定

由图3可知，多糖提取率随着复合酶添加量的增加而逐渐增加；当复合酶添加量达到2.0%后，随着复合酶添加量的继续增加，雷竹笋壳多糖提取率不再明显增加，这可能因为复合酶浓度已经接近饱和，雷竹笋壳中的多糖几乎全部溶出，所以多糖提取率不再随着复合酶添加量的增加而显著增加。因此，雷竹笋壳多糖最适宜的复合酶添加量为2.0%。

2.1.4 料液比的确定

由图4可知，多糖提取率随着料液比的增加而逐渐增加；当料液比超过1∶30后，多糖提取率略有增加，但不再明显增加，这可能因为随着溶液浓差的减少，雷竹笋壳中的多糖较难从细胞内溶出，所以多糖提取率不再显著增加。因此，考虑后续扩大生产浓缩能耗，雷竹笋壳多糖料液比选择1∶30。

2.1.5 酶解温度的确定

由图5可知，多糖提取率随着酶解温度的增加而逐渐增大，当酶解温度为55 ℃时，酶解温度取得最大值。这说明在一定范围内增大温度，可以显著提高纤维素酶和果胶酶等复合酶水解细胞壁的效果，有利于内容物溶出，从而提高多糖的提取率。但温度继续升高反而降低了酶活力。考虑到高效使用复合酶，选择55 ℃为最优的复合酶酶解温度。

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 响应面试验结果与分析

通过响应面法，考虑单因素对雷竹笋多糖提取率的显著影响，筛选超声功率（A）、提取时间（B）和复合酶添加量（C）3个因素进行分析，其试验方案及数据结果见表2，方差分析结果见表3。通过Design-Expert软件对响应面数据进行多元回归拟合，得到多糖获得率Y的二次回归拟合曲线方程为Y=2.33+0.107 5A-0.011 2B+0.033 8C-0.035 0AB-0.020 0AC-0.067 5BC-0.056 3A2-0.078 8B2-0.053 8C2。

表3 各因素回归方程的方差分析表

由表3可知，该模型概率值P＜0.000 1，说明该模型显著；失拟项不显著（P=0.118 3），同时说明其他的外界因素对于试验基本没有干扰；由校正决定系数R2adj=0.972 2，模型的决定系数R2=0.987 8，得出该试验的设计较为合理，98.78%响应值的变化可以通过建立的模型进行解释，因此雷竹笋壳多糖得率的实际值和预测值能够比较好地拟合，且试验误差较小，可以用此模型对超声辅助酶解法提取雷竹笋壳多糖的最佳条件进行分析和预测[17]。通过F值的大小比较可以得出，各因素对多糖提取效果的影响顺序为超声功率＞复合酶添加量＞提取时间，并且本次研究所选取的因素范围内，3个因素对雷竹笋壳多糖得率均有明显的影响。

2.2.2 两因素交互作用分析

超声辅助酶解法提取雷竹笋壳多糖试验中超声功率、复合酶添加量和提取时间之间的交互作用对雷竹笋壳多糖提取率的影响结果如图6所示。

通常因子间二者交互效应的明显程度可由响应面的曲面形状的陡缓程度和等高线图的形状来显示，当因子间交互作用明显时，曲面较陡且等高线为椭圆形，若曲面图形中曲面较缓，且等高线趋向于圆形，则说明因子间的交互效应不明显[14,16]。由图6可知，由因子A和B，B和C相互影响的3D曲面图中的曲面比较陡，且等高线密集成椭圆形，说明了超声波功率A与提取时间B、提取时间B与酶添加量C间的交互作用对雷竹笋壳多糖提取率影响很明显；因素A和C间交互作用的曲面图中曲面变化较缓，而等高曲线则趋向于长圆形，说明在超声波功率A和酶添加量C间的交互影响对其多糖提取率并不显著。以上分析出的结果与方差分析出的结果基本一致，说明响应面结果可靠。

2.3 雷竹笋壳多糖最佳提取工艺的确定

通过响应面试验得到雷竹笋壳多糖的最佳提取工艺条件为料液1∶30（g∶mL），超声波功率210 W，提取时间112 min，复合酶添加量2.1%，提取温度55 ℃。在最优条件下雷竹笋壳多糖提取率为2.28%。3次重复试验后得到的雷竹笋壳多糖的平均提取率为（2.24±1.57）%，达到了回归模型预测提取得率的98.24%，说明试验结果与模型拟合良好，响应面模型具有一定可行性。

2.4 抗氧化性结果与分析

2.4.1 DPPH自由基清除率结果分析

如图7所示，当浓度在0.1～0.5 mg·mL-1，雷竹笋壳多糖对DPPH自由基具有显著的清除功能，其清除功能随着浓度的提高而逐步加强。当雷竹笋壳多糖溶液浓度高于0.2 mg·mL-1时，雷竹笋壳多糖对DPPH自由基的清除率不再随着多糖溶液浓度的增加而增大。维生素C阳性对照溶液中对DPPH自由基的清除率明显高于雷竹笋壳多糖。由此可见，雷竹笋壳多糖溶液对DPPH自由基具有清除能力，表现出较高的抗氧化性。

2.4.2 羟自由基清除率结果分析

羟自由基（·OH）是一种活性氧，其可以使红细胞失活，并且是已知的自由基中毒性最大的一种，及时消除身体中的羟自由基对延缓机体衰老以及维持身体健康均具有良好的效果[15]。由图8可知，雷竹笋壳精制多糖可以清除羟自由基并且效果良好，在0.1～0.5 mg·mL-1，多糖质量浓度越高，清除羟自由基的作用越强。当浓度高于0.3 mg·mL-1时，羟自由基的清除率增加变缓。阳性对照液维生素C对羟自由基的清除率优于雷竹笋壳多糖。

2.4.3 还原能力的测定方法

由图9可知，随着雷竹笋壳多糖溶液的增加，其吸光度值的变化不显著，说明雷竹笋壳多糖还原性不高。在相同质量浓度条件下，维生素C的吸光度明显高于雷竹笋壳多糖。

综合考虑，雷竹笋壳多糖在0.1～0.5 mg·mL-1，具有一定的DPPH和羟自由基清除作用，但总体还原力不强。

3 结论

本文选用超声辅助酶法提取雷竹笋壳多糖，以雷竹笋壳多糖提取率为响应值，在单因素试验的基础上，通过响应面试验确定其最佳提取条件为超声功率210 W，酶解时间112 min，复合酶添加量2.1%，提取温度55 ℃。在最优条件下的雷竹笋壳多糖提取率为（2.24+1.57）%，与预测值（2.28%）基本上相吻合。雷竹笋壳多糖浓度在0.1～0.5 mg·mL-1，具有一定的DPPH和羟自由基清除作用，但其还原能力相对薄弱且不如维生素C。其消除能力与雷竹笋壳多糖的质量浓度有明显的关系[17]。本试验的研究成果将对雷竹笋壳的再加工和综合利用提出了理论支撑，并具有相应的参考价值。