食品微生物能力验证的重要因素

◎ 雷兰兰

（陕西省产品质量监督检验研究院，陕西 西安 710048）

能力验证（Proficiency Testing）是利用实验室间比对来判定实验室和检查机构能力的活动，也是认可机构加入和维持国际相互承认协议（MRA）的必要条件之一。对于已经获得或者申请CNAS认可的实验室，参加能力验证活动是强制性的，CNAS-AL07-CNAS《能力验证领域和频次表》中要求食品微生物领域每年至少参加一次能力验证，谈谈参加食品微生物学能力验证的体会。

1 样品前处理

1.1 制订检验方案

收到样品后，先按照说明将样品在适当的条件下进行存放，一般微生物样品多是冷藏和冷冻保存。再指定人员编写该样品考核的检验方案，方案中需包括进行检验的具体时间和结果上报的时间，以及人、机、料、法、环、测6个要素，即进行检验的人员、用到的设备仪器、试剂耗材及其数量、具体标准方法、进行检验的具体实验室和检验过程的具体操作。对于作业指导书有说明的部分，严格按照作业指导书的规定进行操作，对于作业指导书没有规定的操作，则按照本实验室通过认可的现行有效的常用标准规范进行操作。

1.2 样品复溶

使用作业指导书规定的稀释剂，按照规定进行复溶和转移以及润洗，并且在规定的时间内完成该过程。由于有些细菌繁殖速度较快，20 min即可增殖一代，所以要在规定的时间内完成样品复溶及第一梯度稀释液的制备。同时，将剩余的复溶液以及第一梯度稀释液保存在4 ℃左右的冰箱中，以便于第一次检验结果出现问题不能计数时能够进行第二次检验。建议复溶过程由两人进行，一人操作，另外一人监督，若发现问题，及时纠正。

1.3 定量检验

对于定量样品，最重要的一点是做好稀释度的选择。稀释度越高，检验人员的工作量越大；但是，稀释度太低，则可能出现所有平板上的菌落数多不可计，最终无法报告结果。对于国内的能力验证和盲样考核，如果作业指导书上没有建议稀释度的选择，那么一般稀释到10-5即可，如果作业指导书上有建议稀释度，那么就至少要稀释到指定稀释度。例如，本实验室曾经做过大肠菌群的盲样考核，作业指导书上建议稀释至10-7，实际操作时，本实验室检验人员稀释至10-8。结果表明，在合理计数范围内的稀释度为10-6。每一个样品，保证至少由两人同步检验，最后综合比对两人的结果，以减少人员误差。每一个项目，除标准规定所用到的培养基之外，尽量同步使用测试片或者其他等效培养基进行检验，用来作为计数参考，但是最终报告结果时，还是应以标准规定培养基上的结果为准。由于玻璃平皿可能存在不平整的情况或者玻璃不够纯净进而影响平板计数，建议使用一次性的塑料平皿，但是同一个样本尽量使用不同包装中的平皿，防止平皿中抑菌物质残留而影响菌落生长。

2 菌落总数

标准规定是在培养至（48±2）h进行计数，但是在实际检验过程中，如果样品中添加的菌株在两种以上，其中一种生长繁殖速度快且有蔓延趋势，另外一种生长繁殖速度慢。在培养至48 h进行计数时，发现其中一种菌落蔓延重叠，且覆盖另外一种菌落，导致无法完全计数平板上的菌落。对于这种情况，则应该在培养至12、24、36、48 h分别查看平板上的菌落生长情况和数量并记录，以防止菌落蔓延和生长差异导致不能正确计数。如本实验室在做菌落总数能力验证时，发现在培养至12 h时，一种菌落直径已达到2～3 mm，培养至48 h时，该种菌落直径已达到5～10 mm；而另外一种菌落生长繁殖速度慢，培养至12 h时，不能观察到任何菌落痕迹，培养至48 h时，可以观察到直径不到1 mm的细小菌落[1]。

2.1 大肠菌群

目前，大肠菌群的能力验证或盲样考核多为平板计数法，对于大肠菌群的检验，还需要注意的是BGLB验证的过程，标准中说明选取平板菌落数在15～150 CFU的平板，挑取典型和可疑菌落共计10个 BGLB进行发酵验证试验，但是并未说明每个平板挑取10个还是两个平板总共挑取10个。故提出这样的建议，如果平板上菌落形态单一，则两个平板总共挑取10个进行验证，若平板上菌落形态差异较大，则最好是每个平板上挑取10个菌落进行验证，并且对典型和可疑菌落按照比例挑取验证，最终计算结果时，还需要分别计算典型菌落的阳性率和可疑菌落的阳性率。

2.2 霉菌和酵母菌

无论是食品还是化妆品，或者是食品包材，对于霉菌和酵母菌都是同一种培养基进行同步检验，报告结果时就需要按照作业指导书的规定，两个项目分开报两个结果，或者两个项目合计最终报告一个结果。在检验的过程中，由于霉菌生长速度较快，最好在培养第二天开始，每天查看平板上的菌落数并记录，以防止个别霉菌生长太快而最终覆盖平板影响计数结果。在观察平板上的菌落数时，尽量不要拿动平板，以防止霉菌孢子飞散。

2.3 金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌

目前，对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌这两个项目的考核，多为平板计数法，检验方法也类似，都是平板涂布法，加入平板的样液分别为0.3、0.3、0.4 mL。需要注意的是，涂布用的平板在制备凝固之后，最好放在超净工作台上，打开皿盖，开启风机，吹上2～4 h，让平板尽量干燥，加入样液后也才能更好地吸收。

3 定性检验

定性检验过程一般分为样品复溶、前增菌、选择性增菌、平板分离、染色镜检以及生化鉴定。在样品复溶后，取规定数量的复溶液加入增菌液中进行增菌以及后续试验。由于一般定性检验的样品中会加入一种或者几种与目标菌相似的干扰菌，有的干扰菌在增菌液中生长旺盛，甚至超过目标菌而成为增菌液中的优势菌，最后导致平板划线不能分离到目标菌。建议在将复溶液加入增菌液中按照标准规定步骤进行增菌及后续试验时，用接种环从剩余的复溶液中挑取菌液，划线于分离平板进行培养，若发现可疑菌落，则可直接进行后续鉴定。

3.1 平板划线分离

平板划线分离是定性检验的一个关键步骤，好的平板划线操作能够分离出足够的单菌落，用于后续的检验，平板划线不过关的话，甚至可能导致不能分离出单菌落，结果漏检。因此，每位参加微生物定性检验的人员在需要进行平板划线操作时，一定要谨慎操作，务必保证通过划线操作分离出足够的单菌落。

3.2 分离用琼脂平板

在标准规范和实验室能力允许的条件下，尽量使用两种或以上的选择性琼脂平板来划线分离可疑菌落，以保证不漏检。同时，最好将显色培养基作为分离平板之一，虽然显色培养基成本较高，但是其中含有针对目标菌的特异性成分，因此对目标菌均具有良好的分离效果，能够很容易判定是否有目标菌存在，减少检验员的工作量。

3.3 生化鉴定

通过平板划线操作分离到可疑菌落时，则需要进行鉴定。有些检验方法标准也规定除了传统的生化鉴定外，可以使用微生物全自动生化鉴定系统。但是，需要注意的是，全自动生化鉴定系统的数据库里的数据有限，有时候并不能识别出某种细菌，因此建议还是要以标准中规定的传统生化鉴定为鉴定依据。在进行传统的生化鉴定时，最好先将可疑菌落接种至相应的营养琼脂或胰酪胨大豆蛋白琼脂等非选择性琼脂平板上进行纯化培养。一方面，可以对可疑菌增殖；另一方面，因为选择性平板一般含有选择性抑菌成分，甚至也会对目标菌造成伤害，受到伤害的目标菌再拿去进行生化鉴定，其生化特征便没有代表性，结果可能是假阴性而导致漏检，而纯化培养可以使菌的活性与特性得到恢复，以便得到更准确的生化鉴定结果。

3.4 对照菌株

在进行考核样品检验的同时，还需要准备好阳性对照菌株和阴性对照菌株，以备在染色镜检和生化鉴定时作为对照参考。

3.5 血清学试验

有少量的检验标准中将血清学鉴定试验作为必做项目，如GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验》规定对生化鉴定符合沙门氏菌特征的可疑菌还需进行多价菌体抗原（O）和多价鞭毛抗原（H）。在进行血清学试验时，除了选择质量可靠的血清产品，还应该对每批次血清产品进行技术性验收，同时使用阴性菌和阳性菌做好对照试验。对于待测菌，也应该选择标准中规定的特定琼脂培养物来进行血清学试验。

4 报告结果

检验完成后则是分析数据，报告检验结果。不管是定量检验还是定性检验，除了按照标准规定，还应该按照能力验证所附的结果报告单的要求报告结果。填好结果报告单后，校核人员需要仔细查看，防止错误出现。

5 结语

目前看来，现在能力验证的难度越来越高，检验的时间也越来越少，基本上就是按照标准规定的一个检验周期再加上两三天的时间。而这额外的两三天时间里，前期准备大概需要一两天时间，报告结果需要一天时间。因此，需要参加能力验证的实验室，工作人员一定要提前备好相关设备、试剂和耗材，保证实验室所参加的能力验证能够正常进行。