同位素稀释-气相色谱-三重四极杆质谱法测定食品中丙烯酰胺

◎刘朋宇

（沈阳市食品药品检验所，辽宁 沈阳 110122）

食品中的丙烯酰胺（Acrylamide）主要是在食品热加工过程中由游离的天门冬酰胺通过美拉德反应形成的[1-2]，2002年4月，瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学研究人员报道，在煎炸或烘烤土豆和谷物产品时会产生含量较高的丙烯酰胺[3]。2017年，世界卫生组织把丙烯酰胺列在2 类致癌物清单中[4]。因此，对于食品中丙烯酰胺含量的检测研究有很重要的意义。

目前，食品中丙烯酰胺的检测方法通主要有气相色谱法[5-6]、气质联用法[7-9]、液相色谱法[10-11]和液相色谱-串联质谱法[12-14]等。其中气相色谱法灵敏度低、抗干扰能力差、定量准确性低，液相色谱-串联质谱法存在保留时间短，样品干扰物难以去除等问题。气相色谱-串联质谱法具有灵敏度高、选择性强的特点，本实验前处理步骤对国标[15]进行优化，通过将丙烯酰胺衍生成2，3-二溴丙酰胺，采用气相色谱-三重四极杆质谱法对食品中丙烯酰胺含量进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

市售饼干、面包和膨化食品，经粉碎处理，置于-18 ℃冰箱中保存。

丙烯酰胺、13C3-丙烯酰胺，纯度均≥98%；正己烷、乙酸乙酯，均为色谱纯；无水硫酸钠、硫酸铵、硫代硫酸钠、饱和溴水、氢溴酸、溴化钾和大孔硅藻土（600～900 μm），均为分析纯。

Intuvo9000-7000D 气相色谱-三重四极杆质谱联用仪，美国安捷伦公司；R-300 旋转蒸发仪、B-400 均质仪，瑞士步琦公司；MV5 氮吹仪，北京莱伯泰科；MS3 涡旋混合器，德国IKA 公司；H1750 离心机，湖南湘仪。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液和试剂的配制

（1）丙烯酰胺标准溶液。准确称取丙烯酰胺纯品，用超纯水溶解并定容，将标准溶液用超纯水分别稀释至10 μg·L-1、50 μg·L-1、200 μg·L-1、500 μg·L-1和1 000 μg·L-1的标准工作液。

（2）丙烯酰胺内标（13C3-丙烯酰胺）溶液。准确称取13C3-丙烯酰胺标准品，用超纯水溶解并定容，将其稀释至10 mg·L-1。

（3）溴试剂。称取20 g 溴化钾，加40 mL 超纯水，使完全溶解，再加入1.0 mL 氢溴酸和16 mL 饱和溴水，摇匀，用超纯水定容至100 mL，4 ℃避光储存。

（4）0.2 mol·L-1硫代硫酸钠溶液。称取4.96 g硫代硫酸钠用超纯水溶解并定容至100 mL，4 ℃避光储存。

1.2.2 前处理方法

称取2 g 样品于50 mL 离心管中，加入20 μL13C3-丙烯酰胺内标溶液，根据样品的含水量加入10～15 mL 超纯水，2 000 r·min-1振荡提取20 min，然后于10 000 r·min-1离心2 min，取上清液，在上清液中加入硫酸铵15 g，振荡5 min，于10 000 r·min-1离心2 min，取全部上清，备用。

在具砂板玻璃层析柱中，依次装入10 g 无水硫酸钠、2 g 硅藻土。称取5 g 硅藻土与上述试样上清液充分搅拌后，装入层析柱中，静置10 min。用60 mL 正己烷淋洗并弃去，用60 mL 乙酸乙酯以2 mL·min-1的速度洗脱，收集乙酸乙酯洗脱溶液于茄形瓶中，50 ℃旋转蒸发至近干，用3 mL 乙酸乙酯分3 次洗涤茄形瓶残渣，并将其转移至已加入1 mL 超纯水的试管中，涡旋振荡。置于氮吹仪中吹去上层有机相后，待下一步衍生用。

在试样提取液中加入1 mL 溴试剂，涡旋振荡，4 ℃避光放置1 h，加入硫代硫酸钠溶液50 μL，涡旋振荡至无色；加入2 mL 乙酸乙酯，涡旋振荡1 min，于4 000 r·min-1离心5 min，吸取上层乙酸乙酯相至另一试管，氮吹仪中40 ℃吹至近干，加0.5 mL 乙酸乙酯溶解，装入1.5 mL 进样瓶中，待测定。标准系列溶液的衍生：量取标准系列工作液各1.0 mL，加入20 μL13C3-丙烯酰胺内标溶液，按照上述试样衍生步骤操作。

1.2.3 气相色谱-质谱条件

（1）色谱条件。色谱柱：HP-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：65 ℃保持1 min，15 ℃·min-1升至200 ℃，保持1 min，30℃·min-1升至250 ℃，保持5 min；载气：高纯氦气，流速1 mL·min-1；进样口温度：250 ℃；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL。

（2）质谱条件。离子源：EI 源；离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃；四极杆温度150 ℃；溶剂延迟7 min；碰撞气：氮气，1.5 mL·min-1；淬灭气：氦气，2.25 mL·min-1。采集方式：多反应监测（MRM）模式，离子监测参数见表1。

表1 丙烯酰胺及其内标离子监测参数表

2 结果与分析

2.1 丙烯酰胺的气相色谱-三重四极杆质谱分析

多反应监测（MRM）采集模式有着抗干扰、高灵敏度的特点，由于待测样品成分复杂，选择离子扫描模式存在假阳性，故选取MRM 模式进行采集。通过设定10 eV、15 eV、20 eV、25 eV 的碰撞电压（CE），对丙烯酰胺和丙烯酰胺内标进行测定，试验结果表明，子离子质核比越大，所需的CE 越小，通过比较其离子强度最终确定表1 中的质谱采集条件。

2.2 提取溶剂的选择

丙烯酰胺属于高极性化合物，易溶于水、乙醇、乙酸乙酯和丙酮。试验比较了水、乙酸乙酯和丙酮的提取效果，结果表明，经乙酸乙酯和丙酮提取后，提取溶剂中含有较多的脂肪和色素，增加了后续净化步骤的难度。由于水的极性强，样品中的脂肪不易被提取，可减少测定时的干扰，所以本实验选取水作为提取溶剂，与前人研究结论一致[16-17]。

2.3 洗脱液流速和用量的优化

将2 g 大米粉做空白样品按照1.2.2 进行处理，提取溶液加入200 ng 丙烯酰胺，以乙酸乙酯为洗脱溶剂对硅藻土进行洗脱，收集每10 mL 洗脱液为1 段，按1.2.2 步骤衍生并测定，其相对含量与洗脱溶剂的段数的关系见图1。结果表明，当搜集至第6 段乙酸乙酯时，丙烯酰胺被完全洗脱，确定60 mL 为乙酸乙酯的最佳洗脱体积。丙烯酰胺的回收率与洗脱溶剂的流速呈相关性，流速越小，回收率越高，最终确定，流速为2 mL·min-1时，净化效果和时间效率最佳。

图1 每段洗脱溶剂中丙烯酰胺的相对含量图

2.4 方法的线性范围和定量限

按照1.2.3 的分析条件，分别取10 μg·L-1、50 μg·L-1、200 μg·L-1、500 μg·L-1和1 000 μg·L-1的标准工作液1 mL，按照1.2.2 中衍生步骤进行衍生和测定，通过内标法定量，得线性方程为y=0.006 858x，相关系数r=0.998 9。方法的定量限，在空白样品中添加10 μg·kg-1的丙烯酰胺，经1.2.2 步骤处理，以10 倍信噪比计算丙烯酰胺的定量限，得其结果为5 μg·kg-1。

2.5 方法的准确度和精密度

为了验证方法的准确性和可靠性，在面包中添加3 个浓度水平的丙烯酰胺，每个水平6 个平行样，经过上述步骤进行样品前处理和测定，同时对该样品进行处理和测定，得其加标回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表2。

表2 加标回收率和相对标准偏差结果表

由表2 可知，3 个浓度水平下，丙烯酰胺的回收率在86.5%～103.7%，相对标准偏差（RSD）为1.4%～4.3%，说明本方法准确度和精密度均能够达到分析要求。面包样品和加标样品的MRM色谱图见2。

图2 面包样品和加标样品的MRM 色谱图

2.6 实际样品分析

在超市、农贸市场和便利店购买不同品牌的糕点、饼干和膨化食品共计92 份，采用本方法进行测定，结果表明，这3 种热加工食品中不同程度的含有丙烯酰胺，其中最大含量为505 μg·kg-1。

3 结论

通过对丙烯酰胺的样品前处理和测定条件的优化，建立了食品中丙烯酰胺的气相色谱-三重四级杆质谱仪测定方法，该方法的灵敏度高、准确性好，能够满足食品中丙烯酰胺的测定，通过对实际样品的检测，表明丙烯酰胺广泛存在，为其安全标准限量的制定提供了数据基础。