平板计数法检测肉制品中单核增生李斯特氏菌的不确定度分析与评定

◎刘胤璇，王剑飞，杨蕊银，何 磊，白秀珍

（红河州质量技术监督综合检测中心，云南 蒙自 661199）

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytocytogenes，LM）是一种革兰氏阳性杆状细菌，简称单增李斯特菌。单增李斯特菌是引发食物中毒的重要病原菌[1-2]，菌株即使在低温和酸性环境中也能够生存[3]，且李斯特菌可在食物表面形成生物膜，导致食物交叉污染[4-5]。

测量不确定度是表征合理地赋予被测量值的分散性与测量结果相关联的参数[6]，主要反映测量结果的可信程度，为测定结果的准确性分析提供技术支撑[7]，因此评定测量不确定度是衡量测量结果质量的重要指标[8]。本研究在肉制品中定量添加单增李斯特菌标准菌种，通过分析计算检验过程的不确定度，建立平板计数法测定肉制品中单核增生李斯特氏菌的不确定度评定方法，在具体检测中提高科学性和准确性[7,9-10]。

1 材料和方法

1.1 样品

以即食火腿肠为测试样品，加入单增李斯特菌（编号ATCC19111，第2 代工作用菌种）菌悬液，用拍击式均质器拍击2 min 制备成1∶10 的样品匀液。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

T500 电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）、PREVI Color Gram 全自动革兰氏染色仪（法国梅里埃公司）、1 mL/10 mL 移液器（德国普兰德公司）、BD115 培养箱（德国BINDER 公司）、HBM-400C 样品均质器（天津恒奥科技发展有限公司）及数显温湿度计（德国testo 公司）。

1.2.2 试剂

LB 肉汤、李斯特氏菌显色培养基、木糖、鼠李糖、TSA-YE 培养基、SIM 动力培养基、过氧化氢酶、单增李斯特氏菌干制生化鉴定试剂盒。以上试剂生产企业均为北京路桥技术股份公司。

1.3 检验方法

依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）[11]第二法进行检验。在相同实验条件下，两名检验人员分别对相同的10 份样品进行检验，合计进行20 次实验。参照《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[6]、《食品微生物定量检测的测量不确定度评估指南》（RB/T 151—2016）[12]对结果进行不确定度分析评定。

2 结果与分析

2.1 建立数学模型

选择菌落数在15～150 CFU 的条件下建立数学模型（1）。

式（1）中，T-样品中单核增生李斯特氏菌菌落数，单位为CFU·mL-1（g）；A-某一稀释度典型菌落的总数，单位为CFU；B-某一稀释度鉴定为阳性的菌落数，单位为CFU；C-某一稀释度用于鉴定试验的菌落数，单位为CFU；d-稀释因子。

2.2 测量不确定度分析

依照“黑匣子”的方法，确定和分析单增李斯特氏菌不确定度的分量来源[7,9,12-16]，不确定度分量来源见图1。

图1 不确定度分量来源图

2.3 不确定度分量的计算

2.3.1 称量样品引入的相对不确定度urel（Ws）

称量样品引入的不确定度来源：①天平校准的不确定度。T500 电子天平（d=0.1 g） 检定证书最大允许误差为±0.5 g，按矩形分布，。②天平可读性引入的不确定度。天平最小有效数字为0.1 g，按矩形分布，。③天平称量重复性引入的不确定度。电子天平检定证书给出的重复性误差为0，故u（WR3）=0。

2.3.2 制备样品均液引入的相对不确定度urel（Vs）

制备样品均液使用量筒量取225 mL 稀释液，引入的不确定度来源：①温度引起变化的不确定度u（Td）。实验室温度为21.5 ℃，与20 ℃相差1.5 ℃，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃[7]，假设矩形分布，则。②量筒容量允差引入的不确定度。根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[17]规定，250 mL 量筒的容量允差分别为±2.0 mL，假设矩形分布，u（V1-1）=1.154 7 mL。③量筒分辨率的不确定度，225 mL 量筒分辨率为5 mL，假设三角分布，u（V1-2）=1.020 6 mL。

2.3.3 样品10 倍稀释引入的相对不确定度urel（X1）

样品稀释至1∶100，使用1 mL 移液器移取1 mL的1∶10 样品均液至9 mL 稀释液（使用10 mL 移液器移取），引入的不确定度来源：①温度引起体积变化的不确定度u（Td2）。实验室温度21.5 ℃：

②移液器允差的不确定度u(VR2)。根据《移液器检定规程》（JJG 646—2006）[18]规定，1 mL、10 mL 移液器容量允差分别为1.0%、0.6%。假设三角分布，1 mL移液器移取1 mL不确定度u(VR2-1mL)=0.004 1 mL，10 mL移液器移取9 mL 不确定度u(VR2-9mL)=0.022 0 mL。

综合上述两个不确定度，移液器引入的合成不确定度为：

相对不确定度：urel(V2-1mL)=0.004 1÷1=0.004 1，u(V2-9mL)=0.022 1÷9=0.002 5。因此，10 倍稀释引入的相对不确定度urel(X1)=0.004 8。

2.3.4 样品加样体积引入的相对不确定度urel(X2)

1∶10、1∶100 两个稀释度分别用1 mL 移液器移取0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 三个平板，假设三角分布，相对不确定度分别为：0.004 1、0.004 1、0.004 1，合成单次不确定度为

两次加样引入的相对不确定度

2.3.5 重复试验引入的相对不确定度urel(N)

由于重复实验结果的数值偏离比较大，采用统计学对数的方法对其结果的数值进行不确定度计算，检验结果见表1、表2。重复试验引入的相对不确定度来源：

表1 重复检测单增李斯特氏菌含量表（单位：CFU·g-1）

表2 重复检测单增李斯特氏菌含量对数结果表

①重复检验引入的不确定度，

②不同人员实验组间变化引入的相对不确定度：

2.4 相对合成不确定度uc,rel

比较各不确定度分量，分析其产生的原因，计算相对合成不确定度

2.5 扩展不确定的u95rel

实验中，取包含因子k=2，置信概率为95%，则样品中单增李斯特菌含量对数的扩展不确定度u95rel=0.115 0。本次实验测得单增李斯特菌含量对数均值为3.868 4，结果报告为103.8684±0.1150，即单增李斯特菌含量为5 700～9 600 CFU·g-1。

3 结论

食品安全问题是当今社会普遍关注的焦点，如何快速分析食品安全隐患及提高检测准确度是解决食品安全问题的关键。测量不确定度是评价测量值可信度的重要参数。从本次实验结果可以看出，样品称量、稀释、加样、重复实验等都会对实验结果准确度产生影响，其中占主要部分的是重复试验引入的不确定度分量。考虑到不同菌种均匀性、设备、培养基等对结果不确定度均会产生影响，建议对每种目标菌均进行不确定度评定；当更换设备、培养基时应重新对不确定度进行评定[9]。